SpCas9 NLS核酸酶

SpCas9 NLS核酸酶

货      号 SB-EGR233S
规      格 1000 pmol
品      牌 圣尔生物share-bio
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SB-EGR233S SpCas9 NLS核酸酶 1000 pmol 圣尔生物share-bio ¥1680.00
SB-EGR233S SpCas9 NLS核酸酶 100 pmol 圣尔生物share-bio ¥240.00

SpCas9 NLS核酸酶 介绍

产品详情

产品简介

SpCas9-NLS是一种RNA介导的核酸内切酶,来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)。该酶可在crRNAtracrRNA(或两者连接形成的sgRNA)引导下,识别双链DNA靶标中PAM序列(5'- ngG)上游与sgRNA spacer序列互补的位置,并在PAM上游第3个碱基前端切割DNA双链。

SpCas9-NLS常用于基因编辑,为提高细胞内编辑效率,本品N端带有猴病毒40(SV40)T抗原核定位序列(NLS)。本品亦可用于体外靶标DNA的剪切和基因克隆等。

失活条件

85°C温浴5 min

质量控制

蛋白纯度:使用SDS-PAGE凝胶电泳检测,蛋白纯度不低于95 %

非特异性内切酶活性:将10pmol SpCas9-NLS200 ng超螺旋质粒DNA37°C温育4h,使用琼脂糖凝胶电泳检测,少于10 % 的质粒DNA转变成缺刻或线性状态。

DNase活性:将10pmol SpCas9-NLS15 ng双链DNA片段在37°C温育16h,使用琼脂糖凝胶电泳检测双链DNA底物无变化。

RNase活性:将10pmol SpCas9-NLS500 ngRNA37°C温育1h,使用琼脂糖凝胶电泳检测超过90 % RNA仍保持完整。

使用方法

体外顺式切割实验

①在冰上配制如下反应体系:

试剂

体积

终浓度

10× Cut Buffer C

2 μl

SpCas9-NLS (10 μM)

0.5 μl

250 nM

sgRNA (10 μM)

0.5 μl

250 nM

Target DNA (1 μM)

0.5 μl

25 nM

Nuclease-free water

To 20 μl

-

 如果用凝胶电泳检测切割产物,建议Target DNA用量为100~500 ng,长度在300 bp~3kb之间。建议SpCas9-NLS:sgRNA:TargetDNA的摩尔比为10:10:1,尽量确保靶标DNA被完全切割。

b.sgRNA可参考以下序列设计:

5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG-3'(下划线表示TargetDNA特异性互补配对的spacer序列)

37°C反应30 min~1h后,85°C孵育5 min灭活;

③使用琼脂糖凝胶电泳检测产物。

注意事项

问题1 观察到目的DNA切割不完全。

回答1.2 SpCas9 NucleasegRNAtarget DNA的比例不合适,推荐三者的摩尔比例至少为10:10:1也可以通过适当延长反应时间使反应更加充分。

问题1.2 gRNA的序列有关。根据target DNA选择更合适的gRNA序列,不同的gRNA的效果会差别比较大。

回答1.3 gRNA降解。通过凝胶电泳验证gRNA的完整性。

回答1.4 反应缓冲液不合适。请使用SpCas9 NLS自带的缓冲液10×Buer C

问题2 不同的gRNA之间的消化效率存在差异。

回答2.1 gRNA的序列设计。设计的gRNA需要进行序列与模板的验证。

回答2.2 gRNA的质量。利用琼脂糖凝胶电泳验证gRNA的完整性。

储存条件及期限 于-20℃保存
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搜索MSDS
暂无技术资料

SpCas9 NLS核酸酶 说明书

For research use only. Not intended for human and animal therapeutic or diagnostic use.

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