蛋白Marker应用及完整实验试剂体系
1. 蛋白Marker概述
蛋白Marker（蛋白质分子量标准）是电泳实验中用于估计目标蛋白分子量的一组已知分子量的蛋白质混合物。它们在蛋白质电泳分析中起着至关重要的作用，帮助研究人员确定目标蛋白的分子量大小。
在SDS-PAGE中，蛋白质与SDS结合形成SDS-蛋白质复合物，带负电荷。在电场作用下，这些复合物向正极移动。不同浓度的凝胶适合不同分子量范围的蛋白分离，预染Marker可能比实际分子量迁移稍慢。
2. 蛋白Marker种类
2.1 按分子量范围分类
| 分子量范围(kDa) | 条带 | 适用凝胶类型及典型优势 | 代表产品 |
|---|---|---|---|
| 25-400 |
10个条带——预染Marker 25，45，72，100，130，160，200， 250，300，400 kDa 25 kDa 为绿色，72 kDa 条带为橙红色，400 kDa 为暗红色 |
SDS-PAGE | SB-WB126 |
| 25-300 |
9个条带——预染Marker 25，45，72，100，130，160，200，250， 300kDa 25kDa为绿色，72kDa条带为橙红色 |
SDS-PAGE | SB-WB014 |
| 8-250 |
9个条带——预染Marker 8，16.5，27，33，52，72，95，30，250kDa 8kDa为绿色，27kDa为橙色，72kDa条带为橙红色 |
SDS-PAGE | 👍SB-26619 |
| 10-250 |
11个条带——预染Marker 10，15，20，25，30，40，50，72，100，130，250kDa 25kDa为绿色，72kDa条带为橙红色 |
SDS-PAGE | SB-WB028 |
| 66-669 |
4个条带——非预染Marker 66，238，440，669kDa |
Native-PAGE； 迁移率准确； 适用于未知大小蛋白筛查 |
SB-WB130 |
| 10-180 |
10个条带——预染Marker 10，16.5，25，31，41，52，72，95， 130，180kDa 10kDa为绿色，72kDa条带为橙红色 |
SDS-PAGE | 👍SB-26616 |
| 10-180 |
11个条带——预染Marker（去His标签） 10，15，20，25，30，40，50，72，100，130，180kDa 25kDa为绿色，72kDa条带为橙红色 |
SDS-PAGE | SB-WB029 |
| 8-180 |
10个条带——预染Marker 8，17，25，33，43，55，72，100， 130，180kDa 25kDa为绿色，72kDa条带为橙红色 |
SDS-PAGE | SB-WB129 |
| 2.6-40 |
低分子量（9个条带）预染Marker 2.6，4.2，7，10，15，20，25，30， 40kDa 10kDa为绿色，40kDa条带为橙红色 |
Tricine-SDS-PAGE； 小分子肽段分析 |
SB-WB120 |
2.2 按标记方式分类
| 类型 | 特点 | 优势 | 局限性 |
|---|---|---|---|
| 预染Marker | 蛋白质预先染色 |
直接使用，无需煮沸、稀释和加还原剂处理； 电泳过程可视化，方便监控 |
可能影响迁移率 |
| 非预染Marker | 电泳后染色 | 迁移率准确 | 需额外染色步骤 |
2.3 按组成成分分类
- 单一蛋白Marker：由单一类型的重组蛋白组成，分子量精确
- 混合蛋白Marker：由多种不同分子量的蛋白质混合而成
- 天然蛋白Marker：从天然来源纯化的蛋白质
- 重组蛋白Marker：通过基因工程表达的蛋白质
- 常用Marker蛋白：牛血清白蛋白(BSA, 66 kDa)、卵清蛋白(OVA, 45 kDa)、碳酸酐酶(29 kDa)、溶菌酶(14.3 kDa)、胰岛素(5.7 kDa)，适用于自制Marker，稳定性及重复性不如商业验证过的产品。
3. 蛋白Marker的应用及作用
3.1 SDS-PAGE电泳
- 估计目标蛋白的分子量
- 监控电泳进程
- 评估电泳分离效果
- 比较不同凝胶间的电泳结果
3.2 Western Blot
- 确认转膜效率
- 判断蛋白分离情况
- 作为分子量参考
- 某些特殊Marker可作为内参
3.3 2D电泳
- 第一向等电聚焦的pH范围确认
- 第二向SDS-PAGE的分子量参考
3.4 其他应用
- Native-PAGE中评估蛋白天然状态下的分子量
- 蛋白质纯化过程中监测分离效果
- 教学实验中演示电泳原理
- 其他实验验证内参
注意：不同电泳方法应选择相应的蛋白Marker。例如，SDS-PAGE通常使用变性的蛋白Marker，而Native-PAGE则需要非变性的蛋白Marker。
4. 使用蛋白Marker注意事项
4.1 储存与处理
- 按照说明书要求储存（通常-20°C）
- 避免反复冻融，可分装保存
- 使用前充分溶解并混匀
4.2 上样建议
- Marker应上样在凝胶的两侧或中间位置
- 上样量根据说明书推荐，通常5-10μL
- 避免Marker条带过浓或过淡
4.3 数据分析
- 建立标准曲线时使用所有可见条带
- 对于非线性区域的数据应谨慎处理
- 考虑凝胶浓度对分子量估计的影响
4.4 常见问题解决
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 条带模糊 | 降解或污染 | 使用新鲜Marker，避免污染 |
| 条带缺失 | 上样量不足或Marker过期 | 增加上样量，检查有效期 |
| 迁移异常 | 电泳条件不当 | 检查缓冲液和电压 |
| 条带扭曲 | 凝胶制备问题 | 重新制备凝胶或直接选用成品预制胶 |
部分测评结果展示
以下展示圣尔部分Marker产品与进口和国产的对应产品在几种电泳缓冲液中的电泳结果，从结果中可以看出圣尔Marker与进口产品效果相当。
同时，圣尔还对各种手工胶、预混液和预制胶及缓冲体系进行测评，Share-bio预染蛋白marker条带质量表现最好；另经测评，在上层胶加染料对Share-bio预染蛋白marker基本无影响。（如需相关测评结果，可联系圣尔市场部获取）
以下为电泳相关其他试剂介绍
5. SDS-PAGE电泳试剂体系
5.1 电泳体系
常见的有Tris-Glycine体系、Tris-Hepes体系、Bis-Tris体系及Tris-Tricine体系。
5.2 经典凝胶及电泳体系
适用于大多数蛋白(10-200kDa)，浓缩胶pH6.8/分离胶pH8.8形成不连续PH系统，在高电场强度的条件下实现样品在浓缩胶与分离胶界面堆积。
5.2.1 凝胶组成
| 组分 | 分离胶(12%) | 浓缩胶(5%) |
|---|---|---|
| 丙烯酰胺/Bis (30%) | 4.0 mL | 0.65 mL |
| 1.5M Tris-HCl (pH8.8) | 2.5 mL | - |
| 1.0M Tris-HCl (pH6.8) | - | 0.5 mL |
| 10% SDS | 100 μL | 50 μL |
| 10% APS | 100 μL | 50 μL |
| TEMED | 10 μL | 5 μL |
| ddH2O | 3.3 mL | 3.8 mL |
5.2.2 电泳缓冲液
25mM Tris, 192mM甘氨酸, 0.1% SDS (pH8.3)
5.3 不同浓度凝胶体系
| 凝胶浓度 | 丙烯酰胺用量(30%储存液) | 最佳分离范围(kDa) | 适用蛋白类型 |
|---|---|---|---|
| 8% | 2.7 mL | 30-200 | 大分子量蛋白复合物 |
| 10% | 3.3 mL | 20-150 | 常规蛋白分析 |
| 12% | 4.0 mL | 15-100 | 中等分子量蛋白 |
| 15% | 5.0 mL | 10-70 | 小分子量蛋白 |
| 梯度胶(4-20%) | 梯度混合 | 10-300 | 未知分子量筛查 |
注： 表中用量为制备10mL分离胶时的30%丙烯酰胺/Bis溶液用量，其他组分按比例调整。
5.4 常见电泳体系对比
| 体系 | 核心缓冲物质 | 典型pH范围 | 最佳分离范围（kDa） | 常规电泳时间（迷你胶） | 质谱兼容性 | 最佳应用 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Tris-Glycine | Tris + 甘氨酸 | 6.8-8.8 | 10-200 | 60-90min | 差（甘氨酸干扰） | 常规蛋白分析 |
| Bis-Tris | Bis-Tris + MOPS/MES | 6.4-7.2 | 2-200 | 35min | 良 |
磷酸化/糖基化蛋白/膜蛋白分析； 翻译后修饰研究； 快速检测 |
| Tris-Hepes | Tris + Hepes | 7.0-9.0 | 5-250 | 40min | 优 |
质谱前处理； 快速检测 |
| Tris-Tricine | Tris + Tricine | 8.1-8.9 | 1-100 | 90-120min | 中（Tricine干扰） | 小分子肽段检测 |
关键注意事项：
- 不同体系的Marker迁移率差异显著
- Tris-Tricine系统需特殊三凝胶层设计（分离胶+间隔胶+浓缩胶）
- Bis-Tris凝胶必须配套MOPS/MES缓冲液
- Tris-Hepes系统染色前需延长脱色时间（去除Hepes残留）
5.5 常见预制胶
| 材质 | 适合缓冲液体系 | 胶浓度 | 蛋白分离范围 | 孔数 | 产品编号 |
|---|---|---|---|---|---|
| 玻璃预制胶 | Tris-glycine | 6% | 60-200kDa | 10 | SB-TG1000615 |
| 15 | SB-TG1500615 | ||||
| 7.5% | 50-200kDa | 10 | SB-TG1007515 | ||
| 15 | SB-TG1507515 | ||||
| 8% | 40-200kDa | 10 | SB-TG1000815 | ||
| 15 | SB-TG1500815 | ||||
| 10% | 20-160kDa | 10 | SB-TG1001015 | ||
| 15 | SB-TG1501015 | ||||
| 12% | 15-85kDa | 10 | SB-TG1001215 | ||
| 15 | SB-TG1501215 | ||||
| 15% | 10-50kDa | 10 | SB-TG1001515 | ||
| 15 | SB-TG1501515 | ||||
| 4-12% | 20-200kDa | 10 | SB-TG1041215 | ||
| 15 | SB-TG1541215 | ||||
| 4-15% | 20-200kDa | 10 | SB-TG1041515 | ||
| 15 | SB-TG1541515 | ||||
| 4-20% | 5-200kDa | 10 | SB-TG1042015 | ||
| 15 | SB-TG1542015 | ||||
| 8-16% | 10-200kDa | 10 | SB-TG1081615 | ||
| 15 | SB-TG1581615 | ||||
| 8-20% | 3-200kDa | 10 | SB-TG1082015 | ||
| 15 | SB-TG1582015 | ||||
| Tris-hepes | 6% | 60-200kDa | 10 | SB-TH1000615 | |
| 15 | SB-TH1500615 | ||||
| 7.5% | 50-200kDa | 10 | SB-TH1007515 | ||
| 15 | SB-TH1507515 | ||||
| 8% | 40-200kDa | 10 | SB-TH1000815 | ||
| 15 | SB-TH1500815 | ||||
| 10% | 20-160kDa | 10 | SB-TH1001015 | ||
| 15 | SB-TH1501015 | ||||
| 12% | 15-85kDa | 10 | SB-TH1001215 | ||
| 15 | SB-TH1501215 | ||||
| 15% | 10-50kDa | 10 | SB-TH1001515 | ||
| 15 | SB-TH1501515 | ||||
| 4-12% | 20-200kDa | 10 | SB-TH1041215 | ||
| 15 | SB-TH1541215 | ||||
| 4-15% | 20-200kDa | 10 | SB-TH1041515 | ||
| 15 | SB-TH1541515 | ||||
| 4-20% | 5-200kDa | 10 | SB-TH1042015 | ||
| 15 | SB-TH1542015 | ||||
| 8-16% | 10-200kDa | 10 | SB-TH1081615 | ||
| 15 | SB-TH1581615 | ||||
| 8-20% | 3-200kDa | 10 | SB-TH1082015 | ||
| 15 | SB-TH1582015 | ||||
| 塑料预制胶 | MOPS-SDS | 8% | 40-200kDa | 12 | SB-FP11008 |
| 15 | SB-FP15008 | ||||
| 10% | 20-160kDa | 12 | SB-FP11010 | ||
| 15 | SB-FP15010 | ||||
| 12% | 15-85kDa | 12 | |||
| 15 | SB-FP15012 | ||||
| 4-12% | 20-200kDa | 12 | SB-FP11412 | ||
| 15 | SB-FP15412 | ||||
| 4-20% | 5-200kDa | 12 | SB-FP11420 | ||
| 15 | SB-FP15420 | ||||
| 玻璃预制胶 | Tris-Acetate | 3-8% | 45-400kDa | 10 | SB-TA2001-38T |
预制胶优势： 重复性好，节省时间，适合标准化实验；劣势： 成本较高，灵活性低。
5.6 SDS-PAGE常见问题及解决方案
| 问题现象 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 条带模糊 | 凝胶聚合不均匀 | 确保APS和TEMED新鲜，充分混匀 |
| 条带弯曲 | 电泳发热不均 | 降低电压，使用冷却系统 |
| 蛋白迁移异常 | SDS结合不充分 | 增加样品煮沸时间(5-10分钟) |
| 低分子量蛋白丢失 | 凝胶孔径太小 | 改用高浓度胶或Tricine系统 |
| Marker条带异常 | 预染Marker降解 | 新鲜分装，避免反复冻融 |
优化建议：
- 精确控制凝胶聚合时间（分离胶30-45min，浓缩胶15-20min）
- 上样量控制在10-20μL（含5-20μg蛋白）
- 电泳初期80V使样品堆积，进入分离胶后调至120-150V
- 使用新鲜配制的电泳缓冲液（SDS易析出）
6 其他相关试剂
| 应用 | 类别 | 推荐产品 |
|---|---|---|
| 获取蛋白 | 纯化 | SB-NM001，SB-NM003，SB-NM019，SB-NM017，SB-NM013等 |
| SDS-PAGE | 电泳缓冲液 | SB-CPR005S，SB-CPR002S，SB-EQ0003，SB-EQ0002，SB-CPR010，SB-CPR015，SB-BR025等 |
| SDS-PAGE | 上样缓冲液 | SB-PR037F，SB-ES008，SB-PR041，SB-PR039等 |
| SDS-PAGE | 电泳体系 | DYY-300，DYY-1000C等DYY系列，1658001/DYC-MINI4等DYC系列 |
| SDS-PAGE | 染色液 | SB-WB207，SB-WB206，SB-WB209，SB-D4090 |
| Western Blot | PVDF膜及NC膜 | SB-WB308，SB-WB309，SB-WB310，SB-WB311，SB-WB312，SB-WB313 |
| Western Blot | 转膜缓冲液 | SB-CPR037 |
| Western Blot | 封闭液 | SB-PR079 |
| Western Blot | 抗体及抗体稀释液 | SB-WB008等 |
| Western Blot | ECL发光液 | SB-WB004，SB-WB001，SB-WB011，SB-WB012 |
