抗FLAG标签纳米抗体琼脂糖珠(IP/Co-IP)Anti-Flag VHH Agarose Beads

【产品概述】

抗Flag标签纳米抗体琼脂糖珠用于免疫沉淀Flag标签(DYKDDDDK)的融合蛋白，由识别Flag标签的纳米抗体与琼脂糖珠共价结合组成。纳米抗体微珠用于免疫共沉淀实验，IP复合物无论采用非变性洗脱还是变性洗脱均不会出现抗体的轻、重链污染问题，而且亲和力强，结合量高，特异性强，兼容性好，稳定性好。适用于哺乳动物、植物、细菌、酵母、昆虫等各种生物的细胞提取物。

【微珠属性】

适用范围  IP、co-IP、ChIP、RIP、酶活测定、质谱分析

微珠浓度  50% solids

微珠直径  45-165 μm（4%交联琼脂糖珠）

适用抗体种属  Flag标签的融合蛋白

蛋白载量  每10 μL 微珠悬液结合15-20μg含Flag标签的融合蛋白

耐受高温  55℃

微珠储液  1×PBS，25% glycerol和0.02% 叠氮化钠

配基  羊驼纳米抗体（抗体分子量仅14 kDa，融合6×His标签）

【试剂准备】

注意：使用前在Lysis buffer、Wash buffer或IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer（圣尔#SB-IP011）中添加适量的蛋白酶抑制剂。

【使用说明】

1 收集细胞：对于一个免疫共沉淀反应，推荐使用10⁶-10⁷个表达Flag标签融合蛋白的哺乳动物细胞。吸出生长培养基，向培养皿中加入2 mL预冷的1×PBS洗涤细胞2次，利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，1200×g离心3-5分钟并丢弃上清液。

2 裂解细胞：

2.1 对于细胞质蛋白，用200μL 预冷Lysis buffer重悬细胞。

对于核蛋白可选择：在RIPA buffer中加入1mg/ mL DNase、2.5 mM MgCl₂、蛋白酶抑制剂和1 mM PMSF。

2.2 将离心管放在冰上30-40分钟，每隔10分钟重悬细胞一次。

2.3 离心4°C,12,000×g离心10分钟，将上清液转移到一个新的预冷离心管中，加入300 μL Wash buffer(可用1×PBS代替)，弃沉淀（如需要，保存50 μL裂解液进行进一步分析）。

3 微珠预平衡

3.1 手动混匀微珠悬液，吸取25 μL到新管中。

3.2 加入提前预冷的500 μL Wash buffer或1×PBST（0.05% Tween-20）。

3.3 离心：4°C,1200×g离心3分钟，去掉上清，重复2次。

4 结合蛋白

4.1 将细胞裂解后获得的上清液加入平衡后微珠悬液中，4°C上下颠倒孵育1-3小时。

4.2 低温离心：4°C,1200×g离心3分钟，去掉上清。

5 洗涤

5.1 加入500 μL Wash buffer或1×PBST重悬微珠。

5.2 离心：4°C,1200×g离心3分钟，去掉上清，重复2-5 次。

6 洗脱蛋白：根据后续检测方案选择不同的洗脱方法

6.1 变性洗脱法（此方法洗脱的样品适用于PAGE、WB检测）

彻底吸去剩余的上清液,加入30-50 μL的2×SDS-PAGE loading buffer重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍稍微量离心让样品沉淀。将样品加热95°C，10分钟。分离微珠，将上清液转移到新管。上清液为样品，用于后续SDS-PAGE、WB分析。

6.2 非变性洗脱法（此方法保持原有的生物活性，可用于功能分析、质谱分析，也适于抗体纯化）

分离微珠，弃上清，向微珠中加入50 μL蛋白洗脱缓冲液（酸性），在室温或低温不停吹打或震荡30-60秒。室温洗脱比4°C效率更高，建议酸性洗脱缓冲液在室温下预温。分离微珠，收集上清至新管，并立即加入5 μL的中和缓冲液，使洗脱产物pH调节至中性，样品用于后续分析。

6.3 多肽竞争洗脱法：（此方法为非变性洗脱法，洗脱后的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析）

取适量Flag多肽溶解于1×TBS中，配置成200 μg/mL Flag洗脱液。向微珠中加入100 μL多肽洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温摇晃孵育30-60分钟，或4°C孵育4-6小时。孵育完成之后，分离微珠，将上清转移到新的离心管，上清即为洗脱的Flag标签蛋白。

【注意事项】

1 严禁冻结。

2 密闭保存，避免干燥，保持微珠浸于储液。

3 本品为悬液，使用前需充分混匀，微珠彻底悬浮后吸取，使用过程中避免高速离心。

4 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，强烈建议在蛋白样品、Lysis buffer、Wash buffer中都添加适量的蛋白酶抑制剂。细胞裂解物可置于-80°C下长期保存。

5 裂解核蛋白，可在PIPA（强）裂解液中加入1mg/mL DNaseI、2.5 mM MgCl₂、蛋白酶抑制剂和1 mM PMSF。

6 在结合反应过程中，微珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象。

7 质控取样点1：样本充分裂解后，取数十微升样本，记作Input，即为反应前样本；质控取样点2：样本免疫沉淀孵育结束后，取上清样本10-50 μL，记作supernatant，即为上清样本。

8缓冲液最大兼容性：1mM DTT（二硫苏糖醇）；3 M 脈盐•HCI；8 M 尿素；2 M NaCl；2% NP-40；1% SDS；1% Triton X-100

【常见问题】

问题1 目标条带较弱/没有

可能原因：样品降解，需添加蛋白酶抑制剂，所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融；抗体浓度太低，需增加抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度；抗体亲合力太低，选用适合于IP/co-IP的相应抗体。

问题2 背景太高

可能原因：在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前增加微珠预洗、免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂，如在第二次洗涤的步骤中增加NaCl浓度到500 mM）；改用高严谨度裂解液；使用洁净的仪器或液体；不要接触WB的膜转移面。

问题3 杂带较多

可能原因：微珠的非特异性结合，或者样本上样量过高、或者抗体浓度过高。建议实验前对微珠增加漂洗，实验过程中增加洗涤次数，使用合适的样品和抗体浓度。

本产品仅供科研使用。