抗GFP纳米抗体磁珠(IP/Co-IP)Anti-GFP VHH Magnetic Beads

【产品概述】

抗GFP纳米抗体磁珠是由一种抗绿色荧光蛋白（GFP）重组纳米抗体与超顺磁性琼脂糖磁珠共价结合组成。纳米抗体微珠用于免疫共沉淀实验，IP复合物无论采用非变性洗脱还是变性洗脱均不会出现抗体的轻、重链污染问题，而且亲和力强，结合量高，特异性强，兼容性好，稳定性好。可用于从哺乳动物、植物、细菌、酵母、昆虫等各种生物的细胞提取物中免疫沉淀GFP标记的融合蛋白。

【微珠属性】

适用范围  IP、co-IP、ChIP、RIP、酶活测定、质谱分析

磁珠浓度  40% solids

适用抗体种属  绿色荧光蛋白及其衍生物

蛋白载量  20μg蛋白/μL磁珠

亲和常数（KD）  约1pM

耐受高温  55℃

磁珠储液  20% 乙醇

配基  羊驼纳米抗体（抗体分子量仅14 kDa)

每反应推荐用量  10μL

【试剂准备】

注意：使用前在Lysis buffer、Wash buffer或IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer（圣尔#SB-IP011）中添加适量的蛋白酶抑制剂。

【使用说明】

以下方案描述了哺乳动物细胞裂解物的制备。对于其他类型的细胞，我们建议使用500µg细胞提取物，并从微珠平衡步骤开始实验。

1 细胞裂解

注意:使用预冷的缓冲液收获细胞并裂解细胞。强烈建议将蛋白酶抑制剂添加到裂解缓冲液中，

以防止目标蛋白及其结合物降解。对于一次免疫沉淀反应，我们推荐使用约10⁶-10⁷个细胞。

1.1 收集细胞，并加入预冷的完全裂解缓冲液。通过上下吹打将细胞团重悬于1 mL预冷的Lysis buffer中。

注：Lysis buffer使用前，需要额外添加完全蛋白酶抑制剂混合液。

1.2 冰上放置30分钟，然后每10分钟用移液管反复吹打5次。

1.3 低温离心4°C,17,000×g离心细胞裂解液10分钟。将澄清的裂解物（上清液）转移到预冷EP管中，如果需要，可保存50 μL 稀释的裂解物用于进一步分析（input对照）。

2 微珠平衡

2.1 通过200 μL移液枪吹打或上下颠倒轻弹EP管彻底悬浮微珠。不要漩涡微珠!

2.2 将10μL /反应的微珠悬浮液（4 μL干beads，可根据样品适当调整用量）转移到1.5 mL的离心管中。

2.3 加入1 mL预冷的裂解缓冲液，颠倒洗涤。

2.4 用磁力架分离微珠，直到上层溶液澄清。丢弃上清，重复1-2次。

3 蛋白结合

3.1 将裂解物上清加入到平衡的微珠中，每个反应4 μL干beads。

3.2 在4°C上下旋转1小时。

4 洗涤

4.1 用磁力架分离微珠，直到上层溶液澄清。

4.2 如果需要，可保存50μL 上清液用于进一步分析（穿流液/非结合组分）。

4.3 丢弃剩余的上层清液。

4.4 加入1 mL Wash buffer重悬微珠，上下颠倒5次洗涤。

4.5 用磁力架分离微珠，直到上层溶液澄清，丢弃剩余的上清液。

4.6 重复洗涤步骤（步骤4和5）至少两次。

可选：根据IP结果，为了提高洗涤效果，可测试各种盐浓度，如150 mM - 500 mM，和/或添加非离子洗涤剂。

5 洗脱蛋白：根据后续检测方案选择不同的洗脱方法

5.1 变性洗脱法（此方法洗脱的样品适用于PAGE、WB检测）

彻底吸去剩余的上清液,加入30-50 μL的2×SDS-PAGE loading buffer重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍稍微量离心让样品沉淀。将样品加热95°C，10分钟。分离微珠，将上清液转移到新管。上清液为样品，用于后续SDS-PAGE、WB分析。

5.2 非变性洗脱法（此方法保持原有的生物活性，可用于功能分析、质谱分析，也适于抗体纯化）

分离微珠，弃上清，向磁珠中加入50 μL蛋白洗脱缓冲液（酸性），在室温或低温不停吹打或震荡30-60秒。室温洗脱比4°C效率更高，建议酸性洗脱缓冲液在室温下预温。分离微珠，收集上清至新管，并立即加入5 μL的中和缓冲液，使洗脱产物pH调节至中性，样品用于后续分析。

6 beads再生

酸性洗脱条件下，立即用中性缓冲液（如PBS）洗涤中和，收集后于4°C保存，磁珠可以再生使用，在常规使用条件下，

beads可在不明显影响磁珠性能的情况下再生使用至少10次。

6.1 使用5倍磁珠体积的蛋白洗脱缓冲液（酸性），颠倒洗涤磁珠5分钟。重复3次。

6.2 使用5倍体积的20%乙醇洗涤磁珠，颠倒洗涤磁珠5分钟。重复5次。

6.3 吸净液体后，加入20%乙醇重悬磁珠即可，并于4度保存。

6.4 （选做）再生后的磁珠可取少量磁珠使用SDS loading buffer直接煮样后，用SDS-page考马斯亮蓝染色检查再生情况,同时可与新磁珠比较检查结合效率。

【注意事项】

1 严禁冻结。

2 密闭保存，避免干燥，保持微珠浸于储液。

3 本品为悬液，使用前需充分混匀，微珠彻底悬浮后吸取，使用过程中避免高速离心。

4 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，强烈建议在蛋白样品、Lysis buffer、Wash buffer中都添加适量的蛋白酶抑制剂。细胞裂解物可置于-80°C下长期保存。

5 裂解核蛋白，可在PIPA（强）裂解液中加入1mg/mL DNaseI、2.5 mM MgCl₂、蛋白酶抑制剂和1 mM PMSF。

6 在结合反应过程中，微珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象。

7 质控取样点1：样本充分裂解后，取数十微升样本，记作Input，即为反应前样本；质控取样点2：样本免疫沉淀孵育结束后，取上清样本10-50 μL，记作supernatant，即为上清样本。

8 缓冲液最大兼容性：1mM DTT（二硫苏糖醇）；3 M 脈盐•HCI；8 M 尿素；2 M NaCl；2% NP-40；1% SDS；1% Triton X-100

【常见问题】

问题1 目标条带较弱/没有

可能原因：样品降解，需添加蛋白酶抑制剂，所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融；抗体浓度太低，需增加抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度；抗体亲合力太低，选用适合于IP/co-IP的相应抗体。

问题2 背景太高

可能原因：在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前增加微珠预洗、免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂，如在第二次洗涤的步骤中增加NaCl浓度到500 mM）；改用高严谨度裂解液；使用洁净的仪器或液体；不要接触WB的膜转移面。

问题3 杂带较多

可能原因：磁珠的非特异性结合，或者样本上样量过高、或者抗体浓度过高。建议实验前对微珠增加漂洗，实验过程中增加洗涤次数，使用合适的样品和抗体浓度。

本产品仅供科研使用。