抗V5磁珠(IP/Co-IP)Anti-V5 Tag Magnetic Beads

【产品概述】

V5标签抗体磁珠是一种高性能亲和磁珠，由小鼠源抗体（抗V5标签）与羧基磁珠偶联制备而成，具有高富集、低非特异性结合等特点，可特异性的与含有V5标签的融合蛋白结合。适用于哺乳动物、植物、细菌、酵母、昆虫等各种生物的细胞提取物。

【微珠属性】

适用范围  IP、co-IP、蛋白纯化

磁珠浓度  10 mg/mL

磁珠直径  1μm

适用抗体种属  V5标签的融合蛋白

耐受高温  不耐高温

配基  完整抗体

每反应推荐用量  25-50 μL

【试剂准备】

注意：使用前在Lysis buffer、Wash buffer或IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer（圣尔#SB-IP011）中添加适量的蛋白酶抑制剂。

【使用说明】

本方法以使用50 μL 的磁珠进行免疫沉淀实验为例。可根据实际需要调整磁珠用量至25-50 μL，并参照此说明书体系调整对应试剂的用量；不建议使用超过50 μL，过量的磁珠将增加非特异性结合的可能性。

1 蛋白样品准备

注意：为了获取更好的结果，请确保细胞裂解物或其它样品中含有足够的V5 标签融合蛋白。

1.1 将细胞裂解物离心，14000 rpm、4°C、10 min；

1.2 取上清用 BCA 法测蛋白浓度，并取 10%的上清作为 Input，加入5× Loading buffer，95°C加热 12 min。

2 蛋白纯化

2.1 磁珠预处理：将磁珠涡旋震荡 10s，使用移液枪吹打混匀，使其充分混悬且分散；取20 μL 磁珠悬液置于1.5 mL Ep 管中。加入200 μL 的细胞裂解液，充分混匀，置于磁力架静置 1min，吸弃上清，重复洗涤 2 次。

2.2 磁珠与蛋白样品反应：加入300 μL 细胞裂解物上清（约 300μg 蛋白）；4°C翻转孵育过夜。

选做：孵育过夜结束后，取40 μL 上清，加入10 μL 5× Loading buffer，混匀后95°C加热 10min，标记为 SUP（上清）。此步骤可评估磁珠效价。

2.3 磁珠洗涤：加入500 μL Wash buffer洗涤磁珠 2 遍

2.4 转移：加入500 μL Wash buffer，将磁珠转移到新的1.5 mL Ep 管，磁性分离，去上清。

3 洗脱蛋白：根据后续检测方案选择不同的洗脱方法

3.1 变性洗脱法（此方法洗脱的样品适用于PAGE、WB检测）

彻底吸去剩余的上清液,加入30-50 μL的2×SDS-PAGE loading buffer重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍稍微量离心让样品沉淀。将样品加热95°C，10分钟。分离微珠，将上清液转移到新管。上清液为样品，用于后续SDS-PAGE、WB分析。

3.2 非变性洗脱法（此方法保持原有的生物活性，可用于功能分析、质谱分析，也适于抗体纯化）

分离微珠，弃上清，向磁珠中加入50 μL蛋白洗脱缓冲液（酸性），在室温或低温不停吹打或震荡30-60秒。室温洗脱比4°C效率更高，建议酸性洗脱缓冲液在室温下预温。分离微珠，收集上清至新管，并立即加入5 μL的中和缓冲液，使洗脱产物pH调节至中性，样品用于后续分析。

3.3 多肽竞争洗脱法：（此方法为非变性洗脱法，洗脱后的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析）

取适量V5多肽溶解于1×TBS中，配置成200 μg/mLV5洗脱液。向磁珠中加入100 μL多肽洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温摇晃孵育30-60分钟，或4°C孵育4-6小时。孵育完成之后，分离微珠，将上清转移到新的离心管，上清即为洗脱的V5标签蛋白。

【注意事项】

1 严禁冻结。

2 密闭保存，避免干燥，保持微珠浸于储液。

3 本品为悬液，使用前需充分混匀，微珠彻底悬浮后吸取，使用过程中避免高速离心。

4 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，强烈建议在蛋白样品、Lysis buffer、Wash buffer中都添加适量的蛋白酶抑制剂。细胞裂解物可置于-80°C下长期保存。

5 裂解核蛋白，可在PIPA（强）裂解液中加入1mg/mL DNaseI、2.5 mM MgCl₂、蛋白酶抑制剂和1 mM PMSF。

6 在结合反应过程中，微珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象。

7 当目标蛋白分子量大小为50 kD或者25 kD时，建议更换轻链抗体/重链抗体，或使用纳米抗体磁珠，以尽量减少变性重链或轻链对SDS-PAGE和WB结果产生的干扰。

8 质控取样点1：样本充分裂解后，取数十微升样本，记作Input，即为反应前样本；质控取样点2：样本免疫沉淀孵育结束后，取上清样本10-50 μL，记作supernatant，即为上清样本。

9 缓冲液最大兼容性：1mM DTT（二硫苏糖醇）；3 M 脈盐•HCI；8 M 尿素；2 M NaCl；2% NP-40；1% SDS；1% Triton X-100

【常见问题】

问题1 目标条带较弱/没有

可能原因：样品降解，需添加蛋白酶抑制剂，所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融；抗体浓度太低，需增加抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度；抗体亲合力太低，选用适合于IP/co-IP的相应抗体。

问题2 背景太高

可能原因：在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前增加微珠预洗、免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂，如在第二次洗涤的步骤中增加NaCl浓度到500 mM）；改用高严谨度裂解液；使用洁净的仪器或液体；不要接触WB的膜转移面。

问题3 杂带较多

可能原因：磁珠的非特异性结合，或者样本上样量过高、或者抗体浓度过高。建议实验前对微珠增加漂洗，实验过程中增加洗涤次数，使用合适的样品和抗体浓度。

本产品仅供科研使用。