IP/Co-IP免疫沉淀磁珠（蛋白A/G磁珠）Protein A/G Magnetic Beads

【产品概述】

Protein A/G磁珠是一种高性能亲和磁珠，包被经基因工程改造的、同时含有Protein A及Protein G的IgG结合结构域的重组融合蛋白，具有高容量、低非特异性结合等特点。与单独使用Protein A或者Protein G偶联的磁珠相比，Protein A/G磁珠可从更广泛的物种和同种型范围中捕获抗体或抗原，可应用于细胞裂解物、细胞分泌液上清以及其他的免疫抗原的分离纯化等。本品是免疫沉淀试剂盒（蛋白A/G磁珠法）（圣尔#SB-EX001）的组分之一。

【微珠属性】

适用范围  IP、Co-IP

磁珠浓度  5 mg/mL

磁珠直径  1 μm

IgG结合量  ＞60 μg兔IgG/mg磁珠；＞40 μg鼠IgG/mg磁珠

适用抗体种属  广谱抗体种属

耐受高温  不耐高温

配基  蛋白A/G

【试剂准备】

注意：使用前在Lysis buffer、Wash buffer或IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer（圣尔#SB-IP011）中添加适量的蛋白酶抑制剂。

【使用说明】

本方法以使用50 μL的磁珠进行免疫沉淀实验为例。可根据实际需要调整磁珠用量至25 - 50 μL ，并参照此说明书体系调整对应试剂的用量；不建议使用超过50 μL ，过量的磁珠将增加非特异性结合的可能性。

1抗原样品制备（悬浮细胞、贴壁细胞、组织消化制成的细胞悬液）

1.1 悬浮细胞 离心收集细胞（4°C,500×g,10 min），1×PBS洗涤2次，每1×10⁷个细胞加入1-2 mL细胞裂解液（裂解细胞前需加入蛋白酶抑制剂cocktail及PMSF)，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4°C,14000×g,10 min），取少量样品通过BCA法测定蛋白浓度，其余置于冰上备用（或置于-20°C长期保存）。

1.2 贴壁细胞 移去培养基，1×PBS洗涤细胞一次；去除PBS，每个10 cm的平板/皿加入400 μL细胞裂解液（裂解细胞前需加入蛋白酶抑制剂cocktail及PMSF），放置冰上10 min；用细胞刮刮脱细胞，收集至1.5 mL Ep管内，冰上放置5 min；离心收集上清液（4°C，14000×g，10 min），取少量样品通过BCA法测定蛋白浓度，置于冰上备用（或置于-20°C长期保存）。

1.3 样品稀释 用细胞裂解液将细胞样本稀释至1 mg/mL（组织样本稀释至2 mg/mL），取40 μL稀释后的样本，加入10 μL 5×Loading buffer，混匀后95°C加热10 min，标记为Input。最佳裂解物使用量将取决于目的蛋白的表达水平，建议起始蛋白总量为250 μg-1 mg/样。分别取500 μL稀释后的样本标记为IgG、抗体编号。

2抗原与抗体结合

2.1 添加一抗（按产品数据表中建议的相应稀释度）到细胞裂解物中。在4°C下旋转孵育过夜，从而形成免疫复合物。

设置对照组：建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。

2.2 磁珠预处理及封闭：将磁珠漩涡振荡30 s，超声水浴30 s，使其充分混悬且分散；取50 μL磁珠悬液置于1.5 mL Ep管中。加入1 mL的细胞裂解液，充分混匀，置于磁力架静置1 min，吸弃上清，重复洗涤2次。

封闭步骤（选做）：弃上清后，加入1 mL 3 % BSA封闭液（TBST配置），置于旋转摇床室温孵育30 min，弃上清。此步可进一步降低背景信号。

2.3 磁珠与抗原-抗体复合物反应：抗体孵育完成后，使用迷你离心机短暂离心2 s，将裂解物和抗体（免疫复合物）溶液转移到含有已洗涤磁珠沉淀物的Ep管中，旋转摇床20 rpm室温孵育1 h。孵育完成后，使用迷你离心机短暂离心2s，磁力架静置1 min。

质控步骤（选做）：从抗体编号管中取40 μL 上清，加入10 μL 的5 × Loading buffer，混匀后95°C加热15 min，标记为SUP（上清）。此步骤可评估磁珠效价。

弃孵育管中上清后加入1 mLWash buffer洗涤沉淀物，室温旋转摇床上旋转5 min，磁力架静置1 min，弃去上清，重复洗涤4次后加入500 μL 超纯水洗涤一次，去上清，洗涤间期，保持样品于冰上。

2.4 转移：用200 μL 超纯水将磁珠转移到新的1.5 mL Ep管，磁性分离，去上清。

3 洗脱蛋白：根据后续检测方案选择不同的洗脱方法

3.1 变性洗脱法（此方法洗脱的样品适用于PAGE、WB检测）

彻底吸去剩余的上清液,加入30-50 μL的2×SDS-PAGE loading buffer重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍稍微量离心让样品沉淀。将样品加热95°C，10分钟。分离微珠，将上清液转移到新管。上清液为样品，用于后续SDS-PAGE、WB分析。

3.2 非变性洗脱法（此方法保持原有的生物活性，可用于功能分析、质谱分析，也适于抗体纯化）

分离微珠，弃上清，向磁珠中加入50 μL蛋白洗脱缓冲液（酸性），在室温或低温不停吹打或震荡30-60秒。室温洗脱比4°C效率更高，建议酸性洗脱缓冲液在室温下预温。分离微珠，收集上清至新管，并立即加入5 μL的中和缓冲液，使洗脱产物pH调节至中性，样品用于后续分析。

【注意事项】

1 严禁冻结。

2 密闭保存，避免干燥，保持微珠浸于储液。

3 本品为悬液，使用前需充分混匀，微珠彻底悬浮后吸取，使用过程中避免高速离心。

4 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，强烈建议在蛋白样品、Lysis buffer、Wash buffer中都添加适量的蛋白酶抑制剂。细胞裂解物可置于-80°C下长期保存。

5 裂解核蛋白，可在PIPA（强）裂解液中加入1mg/mL DNaseI、2.5 mM MgCl₂、蛋白酶抑制剂和1 mM PMSF。

6 在结合反应过程中，微珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象。

7 当目标蛋白分子量大小为50 kD或者25 kD时，建议更换轻链抗体/重链抗体，或使用纳米抗体磁珠，以尽量减少变性重链或轻链对SDS-PAGE和WB结果产生的干扰。

8 质控取样点1：样本充分裂解后，取数十微升样本，记作Input，即为反应前样本；质控取样点2：样本免疫沉淀孵育结束后，取上清样本10-50 μL，记作supernatant，即为上清样本。

9 缓冲液最大兼容性：1mM DTT（二硫苏糖醇）；3 M 脈盐•HCI；8 M 尿素；2 M NaCl；2% NP-40；1% SDS；1% Triton X-100

【常见问题】

问题1 目标条带较弱/没有

可能原因：样品降解，需添加蛋白酶抑制剂，所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融；抗体浓度太低，需增加抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度；抗体亲合力太低，选用适合于IP/co-IP的相应抗体。

问题2 背景太高

可能原因：在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前增加微珠预洗、免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂，如在第二次洗涤的步骤中增加NaCl浓度到500 mM）；改用高严谨度裂解液；使用洁净的仪器或液体；不要接触WB的膜转移面。

问题3 杂带较多

可能原因：磁珠的非特异性结合，或者样本上样量过高、或者抗体浓度过高。建议实验前对微珠增加漂洗，实验过程中增加洗涤次数，使用合适的样品和抗体浓度。

本产品仅供科研使用。