NP-40裂解液 NP-40 Lysis Buffer

【产品简介】

NP-40裂解液（NP-40裂解液）是采用一种温和的裂解方法获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(Co-IP)等，该细胞裂解缓冲液不含蛋白酶抑制剂，应在即将使用前补充 1 mM PMSF 和蛋白酶抑制剂混合物。

【产品详情】

NP-40裂解液主要由50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、250 mM NaCl、5mM EDTA、50 mM NaF、1 mM Na₃VO₄、1% NP-40、0.1%ProClean 300等组成。用NP-40裂解液得到的蛋白，可以用BCA蛋白定量试剂盒和Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

【使用方法】

1 贴壁细胞

1.1 取NP-40裂解液置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1 mM，或根据实验需要加入适当的蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。

1.2 去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。

1.3 按照6孔板每孔加入100-200 μl含有PMSF的裂解液的比例，加入NP-40裂解液。移液器轻轻吹打，使裂解和细胞充分接触。置于冰上或4°C裂解15-30分钟，通常裂解液作用于细胞1-3秒内，细胞就会被裂解。

1.4 10000-12000×g，4°C离心5-10分钟（如无低温离心机，室温下离心亦可），取上清。

1.5 进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

2 悬浮培养细胞

2.1 取NP-40裂解液置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1 mM，或根据实验需要加入适当的蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。

2.2 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

2.3 用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入100-200 μl含有PMSF的裂解液的比例，加入NP-40裂解液。通常6孔板每孔细胞加入150 μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200-250 μl，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

2.4 10000-12000×g，4°C离心5-10分钟（如无低温离心机，室温下离心亦可），取上清。

2.5 进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

3 组织样本

3.1 取NP-40裂解液置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1 mM，或根据实验需要加入适当的蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。

3.2 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。

3.3 取在液氮或超低温冰箱中冷冻30分钟以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1-2分钟之内，以减少蛋白的降解。

3.4 按照每20 mg组织加入150-250 μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。冰上或4°C裂解30-60分钟。

3.5 步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20 mg组织加入150-250 μl裂解液的比例，加入含有PMSF的NP-40裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量控制在1-2分钟之内，心减少蛋白的降解。

3.6 10000-12000×g，4°C离心5-15分钟（如无低温离心机，室温下离心亦可），取上清。

3.7 进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

【注意事项】

1 在贴壁培养细胞的操作步骤中，去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。

2 如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

3 在培养细胞的裂解中，如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

4 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切片直接加入裂解液裂解，通过强烈涡旋使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

5 裂解液裂解细胞时，应用于Western和IP时，应尽量缩短溶解时间，避免裂解液中的有效成分失效。

6 细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4°C进行。

7 用NP-40裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用BCA法测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。