RNA Pulldown试剂盒（生物素-探针法） RNA Pulldown Kit (Biotin-Probe)

【产品组成】

【产品简介】

RNA pulldown主要是基于“生物素-链霉亲和素”相互作用的原理建立的实验技术，分RNA直接标记法和探针法，应用于不同的实验需求。RNA直接标记法需首先将RNA基因克隆并连在T7启动子下游，然后借助T7 RNA聚合酶体外转录出目的RNA并对RNA进行末端生物素标记，最后用链霉亲和素磁珠去拉与RNA结合的蛋白或者RNA。此方法主要应用于lncRNA、mRNA等线性RNA。探针法则是根据目的RNA序列特点及空间构象，设计合适DNA或者RNA反义探针并标记生物素，利用碱基互补配对原则富集目的RNA并将RNA结合的蛋白、RNA一并拉出来。此法既可应用于环状RNA也可用于lncRNA、mRNA等线性RNA。本试剂盒是专门为探针法设计的RNA pulldown试剂盒，包含了pulldown及RNA富集所需试剂，可以有效的富集目的环状RNA或者线性RNA以及与其相互作用的蛋白和RNA。

【产品应用】

RNA pulldown结合蛋白质谱可以鉴定与目的RNA相互作用的未知蛋白，探索RNA结合蛋白质组；通过高通量测序可以鉴定与目的RNA相互作用的未知RNA。同时可以通过免疫印迹或者RT-PCR鉴定已知的相互作用。RNA pulldown是研究RNA与蛋白、RNA相互作用，探索RNA生物学功能的必备技术。基于探针法的RNA pulldown技术常见应用场景如下：

筛选鉴定circRNA、lncRNA等RNA结合的蛋白，研究目的RNA对蛋白的翻译、翻译后修饰、细胞定位、活性、稳定性等调控过程。

筛选鉴定mRNA的结合蛋白，研究蛋白对目的mRNA修饰、翻译、稳定性调控。

筛选鉴定circRNA、lncRNA等RNA结合的miRNA，研究目的非编码RNA通过miRNA对mRNA的调控。

【使用方法】

1 实验前准备

1.1 样本类型及样本量 根据实验目的，选择合适的样本类型及样本量。一般一次pulldown实验至少需要做2个反应，即翻译探针和随机序列对照。以2个反应为例，常见哺乳动物细胞系、原代细胞、PBMC、组织推荐样本样品用量如此表：

1.2 探针 反义DNA探针是决定实验成败的关键材料之一。需要根据目标RNA序列设计合成反义探针。circRNA需要以成环点点为中心，左右各20-25个碱基，共45-50个碱基的特异性互补序列，探针的5’末端加3-5个腺嘌呤并在最前一个A的5’端标记生物素。lncRNA和mRNA则可以采用Primer premier或类似工具设计合适的互补配对序列，尽量避免内部重复碱基序列及探针内形成互补，长度为45-50个碱基，在5’末端加3-5个A并生物素标记。阴性对照采用50个碱基的随机序列并在5’末端标记生物素。

1.3 实验场所及防护 RNA实验对环境RNA污染尤为敏感，实验前需要确保实验台清洁，并用RNA酶清除试剂或75%乙醇擦拭干净。如有条件可以全程在生物安全柜或超净台内完成。操作过程佩戴口罩并勤换一次性手套。

1.4 实验试剂耗材 实验前确保所有试剂盒包含试剂耗材及自备试剂耗材足够完成实验。通用试剂耗材尽量不与其他实验混用。

2 样品准备

此步骤对细胞或组织样本进行初步处理以获得均质的细胞裂解产物供后续pulldown实验使用。细胞、组织类型众多，此处只介绍最常见的哺乳动物来源的悬浮细胞、贴壁细胞、原代细胞，组织的裂解流程。非经典样本类型可以咨询技术支持。样本用量以2个反应为例。样品准备及后续实验除加热步骤外，均在冰上操作。

2.1 裂解液准备

样品处理前，根据样品量，配置裂解液，每次实验（以经典细胞2个反应为例）需要400 μL全细胞裂解液，加1 μL RVC（1：400），8 μL蛋白酶抑制剂（1：50），8 μL RNA酶抑制剂（1：50），冰浴备用，1小时内使用。

2.2a 悬浮细胞收集

1. 收取4×10⁷细胞，200×g，室温，离心5分钟，弃培养基上清。

2. 用5 mL RNA free PBS重悬，200×g，室温，离心5分钟，弃上清。

3. 用1 mL RNA free PBS重悬细胞并转移至1.5 mL EP管，1000×g，4°C，离心3分钟，弃上清。

4. 细胞沉淀涡旋震荡松散，小心加入400 μL 全细胞裂解液，轻轻吹打混匀，置于-80°C至少8小时，备用。

 PBMC细胞（或外周血裂红之后的白细胞）可参考悬浮细胞处理。

2.2b 贴壁细胞收集

1. 细胞培养至所需细胞量后，弃培养基上清。

2. 每皿细胞沿壁轻轻加入5mL RNA free PBS，轻轻旋转摇匀5圈，弃上清。

3. 重新加5 mL RNA free PBS，用细胞刮将单细胞层轻轻刮下，全部转移至离心管。

4. 200×g，室温，离心5分钟，弃培养基上清。

5. 1mL RNA free PBS重悬细胞，转移至1.5 mL EP管，1000×g，4°C，离心3分钟，弃上清。

6. 细胞沉淀涡旋震荡松散，小心加入400 μL 全细胞裂解液，轻轻吹打混匀，置于-80°C至少8小时，备用。

 贴壁原代细胞可参考贴壁细胞系处理。

2.2c 哺乳动物组织准备

1. 准备好干净的研钵、研杵、干冰、液氮、无尘吸水纸，药勺。

2. 取约大于50 mg的新鲜组织，准确称量，记录湿重，放入10 cm 培养皿，加入5 mL RNA free PBS，清洗血渍。

3. 研杵放入研钵，倒入适当液氮预冷。

4. 镊子夹住组织悬于无尘吸水纸，吸走表面残留PBS后轻轻放入倒有液氮的研钵。

5. 迅速将组织磨成粉末状后，将研钵放置于干冰表面。如果是冷冻保存的组织，则直接研磨。

6. 1.5 mL EP管预冷，去皮，称取50 mg左右粉末转移至1.5 mL EP管。

7. 小心加入500 μL全细胞裂解液，轻轻吹打混匀，置于-80°C至少8小时，备用。

 植物或真菌组织，可参考哺乳动物组织处理。新鲜组织在研磨前需要清洗干净并吸干肉眼可见水滴，剪碎后液氮研磨。组织量每次实验取50-200 mg，以有效提取4-5 mg蛋白为参考用量。

2.2d 单细胞生物准备

1. 以大肠杆菌为例，收取50 mL对数生长菌液（OD值0.5-1.0），16000×g，离心2分钟，弃培养基上清。

2. 1mL RNA free PBS重悬，转移至1.5 mL EP管，16000×g，4°C，离心2分钟，保留沉淀量100-150 μL。

3. 细胞沉淀涡旋震荡松散，小心加入500 μL全细胞裂解液，冰浴超声破碎。推荐超声条件：功率300W，超声工作时间10s，间歇10s，循环次数20-50次。镜检判断90%以上细菌破碎为准。

4. 超声产物置于-80°C至少8小时，备用。

 其他单细胞生物可参考细菌裂解，取样量视细胞大小和蛋白提取效率而定，以有效提取4-5 mg蛋白为参考用量。超声条件根据有无细胞壁及细胞壁坚固程度适当调整，镜检确认。

2.3 裂解产物分离 通常样本经过温和裂解液化学裂解后，需要-80°C冻存过夜或8小时以上再解冻完成彻底裂解。过夜后取出，冰浴解冻。4°C颠转孵育15分钟。16000×g，4°C，离心10分钟，小心吸取上清裂解产物约450 μL转移至1.5 mL EP管。

3 RNA捕获

3.1 准备磁珠 每个反应取50 μL磁珠，500 μL洗涤缓冲液重悬，置于磁力架，弃上清。500 μL结合缓冲液重复清洗一遍。

3.2 探针包被100 μL 结合缓冲液重悬，加5 ug生物素标记的探针，对照组加5 ug随机对照探针，室温震荡孵育30分钟。

3.3 清洗磁珠 清洗缓冲液、结合缓冲液各洗1遍，弃上清，50 μL结合缓冲液重悬备用。

4 RNA pulldown

4.1 留取Input 准备个1.5 mLEP管，取10 μL裂解产物，Input样本，-20°C暂存过夜。

4.2 配置pulldown反应液 吸取1.6 mL 结合缓冲液，加入16 μL 蛋白酶抑制剂（1:100），16 μL RNA酶抑制剂（1:100），冰浴备用。

4.3 配置pulldown反应体系 上述3.3准备好的磁珠去处50 μL上清后，每管加800 μL 4.1步中配置的含有抑制剂的IP Buffer，2.3步分离的200μL裂解产物。

4.4 pulldown孵育 封口膜包扎好上述反应管，4°C颠转孵育2小时（如果拉RNA时孵育过夜可增加RNA产量）。

4.5 配置洗涤缓冲液1 孵育结束后，吸取4mL结合缓冲液，加入10 μL 蛋白酶抑制剂（1:400），16 μL RVC（1:400），冰浴备用。

4.6 洗涤1 反应管加入1 mL上述洗涤缓冲液1，轻轻颠倒混匀，4°C颠转孵育5-10分钟，取出置于磁力架1-2分钟，待磁珠全部贴壁后弃上清。重复此步骤1-2次，共2-3次。

4.7 洗涤2 反应管加入试剂盒中的洗涤缓冲液1 mL，颠倒混匀，4°C颠转孵育5-10分钟，取出置于磁力架1-2分钟，待磁珠全部贴壁后弃上清。重复此步骤1-2次，共2-3次。

5 产物洗脱

5.1 蛋白产物洗脱 80 μL洗脱缓冲液重悬，加10 μL 10% SDS，10 μL洗脱增强剂，100°C震荡煮沸5-10分钟，取出上清100 μL供免疫印迹或质谱实验，或-20°C保存备用。

5.2 RNA产物洗脱

1.DNA消化 取出Input管，加入DNase I反应体系（表3），吹打混匀，37°C，800rpm，震荡孵育30分钟。

2 蛋白消化 向上述各管加，8 μL 30 mM的EDTA，15 μL 10% SDS，混匀后加15 μL proteinase K，55°C，800 rpm，震荡孵育15分钟。

3 Trizol提取 蛋白消化结束后，EP管瞬时离心，将磁珠组EP管放置于磁力架，静置1-2分钟待磁珠全部贴壁后吸取所有上清至新的EP管。Input和磁珠组每管加1 mL Trizol，吹打混匀，加230 μL氯仿，震荡混匀，冰浴静置3-5分钟至溶液分层。

4.离心分离 16000×g，4°C，离心10分钟，小心吸取上清约650 μL。

5.RNA沉淀 各管加65 μL pH5.4的NaAc，5 μL糖原，震荡混匀，加720 μL异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20°C沉淀1小时或过夜。

6 离心 沉淀反应结束后，16000×g，4°C，离心30分钟，弃上清。

7 洗涤1 加500 μL 75%无水乙醇，轻轻颠倒至沉淀悬浮，16000×g，4°C，离心10分钟，弃上清。

8 洗涤2 加500 μL无水乙醇，轻轻颠倒至沉淀悬浮，16000×g，4°C，离心10分钟，吸尽上清，自然干燥5-10分钟至无明显液滴。

9 RNA溶解 磁珠组20-30 μL DEPC水溶解，Input组50-100 μL DEPC水溶解。

10 RNA定量 RNA可以用Nanodrop、Quibit或Agilent 2100检测浓度及条带，Nanodrop定量可测的总量为200-1000 ng，测量结束后可以采用通用total RNA逆转录试剂逆转录，特异的miRNA引物PCR检测，也可以采用特异的引物逆转录感兴趣的miRNA后进行qPCR鉴定。

【注意事项】

1 本实验的试剂及实验台都要严格控制RNA酶，所有实验操作尽量在生物安全柜或者超净台中完成。操作人员带好手套、口罩。

2 Pulldown拉RNA时，可视情况将步骤2.4延长至过夜，这样可以提高RNA产量，但也会增加非特异结合，孵育过夜的可增加洗涤次数至5-6次。

3 DNase I对RNA有很低的酶切活性，进行DNA消化时务必加RNA酶抑制剂。