抗小鼠纳米抗体琼脂糖珠(IP/Co-IP)Anti-Mouse VHH Agarose Beads

【产品概述】

抗小鼠纳米抗体琼脂糖珠是羊驼纳米抗体（抗小鼠IgG）偶联的琼脂糖珠悬液。适用于所有一抗为兔抗体的免疫沉淀反应。纳米抗体微珠用于免疫共沉淀实验，IP复合物无论采用非变性洗脱还是变性洗脱均不会出现抗体的轻、重链污染问题，而且亲和力强，结合量高，特异性强，兼容性好，稳定性好。适用于哺乳动物（除小鼠外）、植物、细菌、酵母、昆虫等各种生物的细胞提取物

【微珠属性】

适用范围  IP、co-IP、ChIP、RIP、酶活测定、质谱分析

微珠浓度  50% solids

IgG结合量  1 mL琼脂糖微珠能结合约10 mg小鼠IgG

适用抗体种属  小鼠（羊驼抗小鼠）

耐受高温  55℃

微珠储液  20% 乙醇，0.03% 叠氮化钠

配基  羊驼纳米抗体（抗体分子量仅14 kDa)

【试剂准备】

注意：使用前在Lysis buffer、Wash buffer或IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer（圣尔#SB-IP011）中添加适量的蛋白酶抑制剂。

【使用说明】

1 细胞裂解物的预制备：

加50μL微珠悬液到装有500 μL细胞裂解物的微量离心管中，冰上孵育30分钟。10000×g离心3分钟后把上清液转移到新的离心管中。

2 免疫沉淀:

在装有预清洗的细胞裂解物的离心管中加入5μg的一抗，孵育1小时。再加入50μL微珠，在摇床上孵育1小时。将离心管以10000×g离心1分钟。完全去除上清液并用500μL 裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl,pH8.0; 150 mMNaCl; 1%NP-40)洗涤3次。

3 洗脱蛋白：（此方法洗脱的样品适用于PAGE、WB检测）

彻底吸去剩余的上清液,加入30-50 μL的2×SDS-PAGE loading buffer重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍稍微量离心让样品沉淀。将样品加热95°C，10分钟。分离微珠，将上清液转移到新管。上清液为样品，用于后续SDS-PAGE、WB分析。

【注意事项】

1 严禁冻结。

2 密闭保存，避免干燥，保持微珠浸于储液。

3 本品为悬液，使用前需充分混匀，微珠彻底悬浮后吸取，使用过程中避免高速离心。

4 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，强烈建议在蛋白样品、Lysis buffer、Wash buffer中都添加适量的蛋白酶抑制剂。细胞裂解物可置于-80°C下长期保存。

5 裂解核蛋白，可在PIPA（强）裂解液中加入1mg/mL DNaseI、2.5 mM MgCl₂、蛋白酶抑制剂和1 mM PMSF。

6 在结合反应过程中，微珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象。

7 质控取样点1：样本充分裂解后，取数十微升样本，记作Input，即为反应前样本；质控取样点2：样本免疫沉淀孵育结束后，取上清样本10-50 μL，记作supernatant，即为上清样本。

8 缓冲液最大兼容性：1mM DTT（二硫苏糖醇）；3 M 脈盐•HCI；8 M 尿素；2 M NaCl；2% NP-40；1% SDS；1% Triton X-100

【常见问题】

问题1 目标条带较弱/没有

可能原因：样品降解，需添加蛋白酶抑制剂，所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融；抗体浓度太低，需增加抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度；抗体亲合力太低，选用适合于IP/co-IP的相应抗体。

问题2 背景太高

可能原因：在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前增加微珠预洗、免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂，如在第二次洗涤的步骤中增加NaCl浓度到500 mM）；改用高严谨度裂解液；使用洁净的仪器或液体；不要接触WB的膜转移面。

问题3 杂带较多

可能原因：微珠的非特异性结合，或者样本上样量过高、或者抗体浓度过高。建议实验前对微珠增加漂洗，实验过程中增加洗涤次数，使用合适的样品和抗体浓度。

本产品仅供科研使用。