抗mCherry纳米抗体琼脂糖珠(IP/Co-IP)Anti-mCherry VHH Agarose Beads

【产品概述】

抗mCherry纳米抗体琼脂糖珠是由一种抗红色荧光蛋白（mCherry）重组纳米抗体与琼脂糖珠共价结合组成。纳米抗体微珠用于免疫共沉淀实验，IP复合物无论采用非变性洗脱还是变性洗脱均不会出现抗体的轻、重链污染问题，而且亲和力强，结合量高，特异性强，兼容性好，稳定性好。适用于哺乳动物、植物、细菌、酵母、昆虫等各种生物的细胞提取物。

【微珠属性】

适用范围  IP、co-IP、ChIP、RIP、酶活测定、质谱分析

微珠浓度  50% solids

微珠直径  40μm(7.5%交联琼脂糖珠)

适用抗体种属  mCherry

蛋白载量  10μL微珠悬液可结合2-4 μg以上mCherry蛋白

耐受高温  55℃

微珠储液  20% 乙醇

配基  羊驼纳米抗体（抗体分子量仅14 kDa)

每反应推荐用量  25μL

【试剂准备】

注意：使用前在Lysis buffer、Wash buffer或IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer（圣尔#SB-IP011）中添加适量的蛋白酶抑制剂。

【使用说明】

1、收集细胞：

对于一个免疫共沉淀实验，推荐使用10⁶-10⁷个表达mCherry融合蛋白的哺乳动物细胞。吸出细胞培养液，加入1 mL预冷的PBS于细胞中并小心刮下细胞，之后将细胞转入预冷的离心管中，4°C、500×g离心3 分钟，弃上清液。用预冷的PBS轻轻重悬细胞，4°C、500×g 离心 3 分钟，弃上清液。重复上述步骤一次。

2 裂解细胞

2.1 用200 μL预冷的Lysis buffer重悬细胞。

注：在 Lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂 Mix 和 PMSF 至终浓度为 1 mM。对于核蛋白可选做：加入1 mg/mL DNase、2.5 mM MgCl₂、蛋白酶抑制剂 Mix 及 PMSF 到 RIPA 裂解液中至终浓度为 1 mM。

2.2 将离心管放在冰上30 分钟，每隔10 分钟重悬细胞一次。

2.3 低温离心，4°C 、16,000×g 离心10 分钟，将上清液转移到一个新的预冷离心管中，加入300 μL Wash buffer，弃沉淀。

注：此步骤获得的细胞溶解物可置于-80°C下长期保存。

可选做：在稀释液中加入1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂。

3 平衡beads

旋涡anti-mCherry beads，吸取25 μL至预冷的500 μL Wash buffer中，4°C、1200 ×g离心2分钟，去掉上清，重复两次。

4 结合蛋白

4.1 将步骤 2 获得的细胞蛋白提取液加入到平衡后的微珠中。在4°C环境中上下颠倒孵育1 小时。

4.2 低温离心，4°C、1200×g离心2 分钟，弃上清。

5 洗涤beads

加入500 μL预冷的溶解液重悬anti-mCherry beads，4°C、1200×g 离心2分钟，去掉上清，重复两次。

可选做：在第二次清洗中将盐浓度提高至500 mM。

6 洗脱蛋白：根据后续检测方案选择不同的洗脱方法

6.1 变性洗脱法（此方法洗脱的样品适用于PAGE、WB检测）

彻底吸去剩余的上清液,加入30-50 μL的2×SDS-PAGE loading buffer重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍稍微量离心让样品沉淀。将样品加热95°C，10分钟。分离微珠，将上清液转移到新管。上清液为样品，用于后续SDS-PAGE、WB分析。

6.2 非变性洗脱法（此方法保持原有的生物活性，可用于功能分析、质谱分析，也适于抗体纯化）

分离微珠，弃上清，向微珠中加入50 μL蛋白洗脱缓冲液（酸性），在室温或低温不停吹打或震荡30-60秒。室温洗脱比4°C效率更高，建议酸性洗脱缓冲液在室温下预温。分离微珠，收集上清至新管，并立即加入5 μL的中和缓冲液，使洗脱产物pH调节至中性，样品用于后续分析。

6.3 多肽竞争洗脱法：（此方法为非变性洗脱法，洗脱后的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析）

取适量mCherry蛋白溶解于1×TBS中，配置成200 μg/mL mCherry洗脱液。向微珠中加入100 μL多肽洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温摇晃孵育30-60分钟，或4°C孵育4-6小时。孵育完成之后，分离微珠，将上清转移到新的离心管，上清即为洗脱的mCherry标签蛋白。

【注意事项】

1 严禁冻结。

2 密闭保存，避免干燥，保持微珠浸于储液。

3 本品为悬液，使用前需充分混匀，微珠彻底悬浮后吸取，使用过程中避免高速离心。

4 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，强烈建议在蛋白样品、Lysis buffer、Wash buffer中都添加适量的蛋白酶抑制剂。细胞裂解物可置于-80°C下长期保存。

5 裂解核蛋白，可在PIPA（强）裂解液中加入1mg/mL DNaseI、2.5 mM MgCl₂、蛋白酶抑制剂和1 mM PMSF。

6 在结合反应过程中，微珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象。

7 质控取样点1：样本充分裂解后，取数十微升样本，记作Input，即为反应前样本；质控取样点2：样本免疫沉淀孵育结束后，取上清样本10-50 μL，记作supernatant，即为上清样本。

8 缓冲液最大兼容性：1mM DTT（二硫苏糖醇）；3 M 脈盐•HCI；8 M 尿素；2 M NaCl；2% NP-40；1% SDS；1% Triton X-100

【常见问题】

问题1 目标条带较弱/没有

可能原因：样品降解，需添加蛋白酶抑制剂，所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融；抗体浓度太低，需增加抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度；抗体亲合力太低，选用适合于IP/co-IP的相应抗体。

问题2 背景太高

可能原因：在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前增加微珠预洗、免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂，如在第二次洗涤的步骤中增加NaCl浓度到500 mM）；改用高严谨度裂解液；使用洁净的仪器或液体；不要接触WB的膜转移面。

问题3 杂带较多

可能原因：微珠的非特异性结合，或者样本上样量过高、或者抗体浓度过高。建议实验前对微珠增加漂洗，实验过程中增加洗涤次数，使用合适的样品和抗体浓度。

本产品仅供科研使用。