染色质免疫沉淀检测试剂盒（标准版）ChIP Assay Standard Kit

【试剂盒组成】

【产品概述】

染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于表观遗传学研究的技术，可以快速反映蛋白质-DNA相互作用的实验技术。该方法可以先进行样品交联，然后将蛋白质与DNA复合物进行随机DNA切断，再借助免疫学方法特异性富集与目的蛋白相结合的DNA片段，从而检测转录因子等目的蛋白质与DNA的结合情况，鉴定基因启动子或其它DNA结合位点。该方法同时也可应用于研究基因组特定位点的组蛋白修饰情况。

【微珠属性】

适用范围  ChIP

磁珠浓度  10 mg/mL

磁珠直径  1 μm

IgG结合量  >60 μg兔IgG/mg磁珠；>40 μg鼠IgG/mg磁珠

适用抗体种属  广谱抗体种属

耐受高温  不耐高温

配基  蛋白A/G

【试剂准备】

PBS、37%-40%甲醛、ChIP洗脱液（1%SDS，0.1M NaHCO₃）、磁力架（圣尔#SB-IP004）和细胞超声破碎仪。

【使用说明】

1 收集细胞和交联

1.1 收集≥2.5×10⁷细胞，重悬于10 mL新鲜培养基。

12 .每10 mL培养基中加入270 µL 37%-40%甲醛溶液（甲醛终浓度为1%），室温缓慢旋转或震荡10 min将细胞交联。添加甲醛可能导致培养基颜色发生变化。

1.3 终止交联：加入650 µL甘氨酸（2M）溶液（甘氨酸终浓130 mM）。室温缓慢旋转或震荡5 min。添加甘氨酸可能导致培养基颜色发生变化。4°C 1500 rpm，离心5 min，弃上清。

1.4 洗涤：用10 mL预冷的PBS重悬洗涤。4°C 1500 rpm，离心5 min，弃上清。重复此步骤一次。

2 染色质碎裂

2.1 ChIP裂解液中加入蛋白酶抑制剂Cocktail（终浓度为1×），每2.5×10⁷细胞用1 mL ChIP裂解液重悬并吹打至均匀混合，冰浴10 min，以充分裂解细胞。将1 mL细胞悬浮液转移到大小合适的离心管中进行超声处理。

2.2 超声处理染色质，超声处理条件可能需要通过测试不同超声波仪功率和超声处理时长来确定。直至找到比较合适的超声条件可以使大部分基因组DNA断裂成200-1000 bp大小。采用3 mm探头，功率25%，超声4.5 S，间歇9 S，循环14次。通常能产生良好的碎裂性能。

2.3 请确保在超声处理时以及各处理步骤之间将含有染色质的离心管置于冰浴中，以便让染色质样品在超声处理期间保持冷却。切勿让探头接触到离心管底部或离心管壁。如果染色质样品在超声处理期间起泡，则停止超声处理并调整离心管位置。

2.4 完成超声后，4°C 13,400×g离心超声产物5-10min，弃沉淀留上清另管，保存于-80°C。

2.5 取10 µL样本另存，后续用琼脂糖凝胶电泳鉴定超声效果，进行质控。

3 分析染色质碎裂程度

3.1 用于质控的样品用TE缓冲液补充体积到250 µL，加入10 µL ChIP专用盐溶液，65°C金属浴或水浴1小时以上以解交联。

3.2 再加入蛋白酶K 1 µL，55°C金属浴或水浴至少1小时。

3.3 使用DNA纯化试剂从样品中纯化DNA。

3.4 DNA纯化后，通过在1%琼脂糖凝胶上进行电泳来确定DNA片段大小。超声后DNA片段应集中于200-1000 bp，如有较多片段小于200bp或大于1000bp则样本不适用于后续实验。

4 去除背景及IP

4.1 确定免疫沉淀的次数时，计入阳性对照（抗体组）和阴性对照（IgG组）。

4.2 配置足量ChIP缓冲液，预冷并加入蛋白酶抑制剂Cocktail（终浓度为1×）。

4.3 取110 µL 蛋白A/G磁珠（ChIP专用）（按1个反应20 µL，且IP时使用35 µL）。使用ChIP缓冲液预洗3次后，置于4°C或冰上备用。

4.4 用步骤3.4所得产物（1 mL对应细胞2.5×10⁷，若从-80°C取出则先置于冰上15 min，后转移至4°C 15min缓慢解冻），按4×10⁶细胞/每反应，用已备好的ChIP缓冲液补齐到1 mL。

4.5 取出10 µL稀释的染色质样品并将其转移至离心管。这将作为1%Input对照，该样品在后续使用之前可以置于-20°C下贮存。

4.6 进行实验预处理，加入Normal Rabbit IgG抗体2 µL，轻柔颠倒混匀后加入20 µL蛋白A/G磁珠（ChIP专用），4°C缓慢旋转或震荡2小时，此步骤用于去除背景和噪音。

4.7 将样品放在磁分离架上静置5 min，丢弃沉淀取上清转移到新的离心管。

4.8 对于阳性对照，加入10 µLHistone H3抗体。对于阴性对照，加入Normal Rabbit IgG抗体2 µL。

4.9 所有样本4°C缓慢旋转或震荡过夜。

4.10 加入35 µL蛋白A/G磁珠（ChIP专用），4°C缓慢旋转孵育 2h。

5 洗涤、洗脱及解交联

5.1 将Wash Buffer 1、Wash Buffer 2、Wash Buffer 3和TE缓冲液预冷并加入蛋白酶抑制剂Cocktail。

5.2 加入1 mL Wash Buffer 1，4°C缓慢旋转5 min。离心管放在磁分离架上静置5 min，小心地移除上清液。

5.3 加入1 mL Wash Buffer 2，4°C缓慢旋转5 min。离心管放在磁分离架上静置5 min，小心地移除上清液。

5.4 加入1 mL Wash Buffer 3，4°C缓慢旋转5 min。离心管放在磁分离架上静置5 min，小心地移除上清液。

5.5 加入1 mL TE缓冲液，4°C缓慢旋转5 min。离心管放在磁分离架上静置5 min，小心地移除上清液。

5.6 加入150 µL新鲜配制的ChIP洗脱液（不需要加蛋白酶抑制剂Cocktail，碳酸氢钠需要数分钟溶解，建议提前配置）。在65°C下，通过轻轻涡旋(1200 rpm)将染色质从蛋白A/G磁珠上洗脱下来，持续30 min。这个步骤最好使用恒温混匀仪，也可以在65°C金属浴或水浴中频繁混合。

5.7 样品短暂离心10 s，以便回收离心管盖上的蒸发样品。将样品放在磁分离架上静置5 min。将洗脱下来的染色质上清液转移至新离心管。

5.8 用ChIP洗脱液将步骤4.5留样Input对照样品补齐体积150 µL。

5.9. 向所有样品（包括Input对照）加入6 µL 5 M NaCl和2 µL蛋白酶 K，并在65°C下孵育2小时以上，建议孵育过夜。

6 DNA纯化

6.1 按比例加入结合液：150 µL样品需加入350 µL结合液，150 µL样品需加入585 µL结合液），涡旋混匀10 s。

6.2 将纯化柱套在收集管中。把混合液转移至柱子中。8,000×g 离心30-60 s。

6.3 倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加600 µL洗涤液至柱子中，静置2 min，8,000×g离心30-60 s。

6.4 倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加600 µL洗涤液至柱子中。静置2 min，8,000×g离心30-60 s。

6.5 倒弃滤液，把纯化柱套回收集管中，12,000×g离心2 min。

6.6 把柱子套在1.5 mL离心管中，加入20-50 µL预热至55°C洗脱液至柱子膜中央。静置2 min，12,000×g离心1 min。

6.7 丢弃柱子，把DNA保存于-20°C。7 qPCR检测

7.1 配PCR体系：PCR反应应当包括阳性对照组蛋白Histone H3抗体样品、阴性对照、Normal Rabbit IgG抗体样品和1%Input对照样品。每个样品PCR反应设置2-3次重复。1份PCR体系（18 μL）包含：无核酸酶水 6 μL，GAPDH引物 2 μL，2×qPCR Mix 10 μL

7.2 启动以下PCR反应程序：

95°C 预变性3 分钟；

95°C 15 s；60°C 60 s 循环40次

7.3 计算：

ChIP富集效率=1% × 2^(CT 1% Input样品- CT免疫沉淀样品)

【注意事项】

1 严禁冻结。

2 密闭保存，避免干燥，保持微珠浸于储液。

3 本品为悬液，使用前需充分混匀，微珠彻底悬浮后吸取，使用过程中避免高速离心。

4 自备试剂37% 甲醛 Formaldehyde，必须是保质期内的，新鲜的。

5. 提前取出ChIP裂解液放置室温，结晶完全溶解即可使用。

6. 本试剂盒配有供3次使用的Normal Rabbit IgG抗体，必要时用于验证体系。

7. 超声处理会使蛋白A/G磁珠捕获的抗体脱落，

【常见问题】

问题1 片段化的染色质浓度过低

可能原因：用于染色质片段化的细胞数不足，或者胞核在细胞裂解后未完全裂解。在交联之前计算备用培养皿中细胞的数量，以确定准确的细胞数量，或在超声波/酶切处理前后在显微镜下观察胞核，以确认胞核是否完全裂解。

问题2 染色质处理后的片段过大（大于1000 bp）

可能原因：细胞可能已经过度交联。交联超过10 分钟可能会抑制染色质的片段化。在染色质片段化过程中添加了过多的细胞或者超声不足。将甲醛交联时间缩短至少于10分钟或更短。在交联之前计算备用培养皿中细胞的数量，以确定准确的细胞数量。

问题3 染色质过度打碎并且片段过小（只有150 bp单核小体的长度），在PCR定量期间，将染色质完全消化成单核小体长度的DNA可能削弱信号，尤其对于长度大于150 bp的扩增子更是如此。

可能原因：添加至染色质片段化的细胞不足或者超声过度。在交联之前计算备用培养皿中细胞的数量，以确定准确的细胞数量；降低超声强度，或者减少酶的用量和酶切时间。

问题4 Input样品输入对照组PCR反应中无产物或产物很少

可能原因：添加至PCR反应的DNA不足或条件不是最佳。PCR扩增区域可能跨越无核小体的区域。染色质过度片段化。向PCR反应中添加更多DNA或增加扩增循环次数。使用来自交联并消化后的染色质的纯化DNA，优化实验引物序列和PCR条件。设计不同的引物对并将扩增子的长度减少到小于150碱基对。

问题5 阳性对照组蛋白Histone H3抗体IP后目的基因引物的PCR反应中无产物

可能原因：添加至IP反应的染色质或抗体不足，或者IP孵育时间过短。Protein A/G磁珠捕获的DNA片段洗脱不完全。确保向每次IP反应中添加5-10 μg染色质和10 μL抗体并和抗体一起孵育过夜。在添加Protein A/G磁珠后需额外孵育2个小时。在洗脱时可增加在65℃高温孵育3- 5小时的步骤，加强解交联。需要频繁混合以保持磁珠悬浮在溶液中。

问题6 阴性对照Mouse/Rabbit IgG的PCR反应中产物数量也相当多。

可能原因：添加至IP反应的染色质过多。或者，添加至IP反应的IgG用量过多。添加至PCR反应的DNA过多或扩增循环次数过多。向每次IP反应中添加不超过15 μg的染色质。每次IP将Normal Mouse/Rabbit IgG缩减至1 µL/IP管。向PCR反应中添加更少的DNA或减少PCR循环次数。在PCR的线性扩增阶段范围内分析PCR产物极为重要。否则，不能准确测量起始DNA数量的差异。

问题7 实验目的抗体IP后PCR反应中无产物

可能原因：添加至PCR反应的DNA不足；添加至IP反应的抗体量不足或不适用。向PCR反应中添加更多DNA或增加扩增循环次数。通常，需向IP反应中添加1至5 µg的抗体；但是，实际加入量很大程度上取决于各个抗体本身。增加添加至IP反应的抗体量。或者尝试其他替代抗体。

本产品仅供科研使用。