IP/Co-IP免疫沉淀试剂盒（蛋白A/G磁珠法）Protein A/G Magnetic Beads Kit

【试剂盒组成】

【产品概述】

Protein A/G磁珠是一种高性能亲和磁珠，包被经基因工程改造的、同时含有Protein A及Protein G的IgG结合结构域的重组融合蛋白，具有高容量、低非特异性结合等特点。与单独使用Protein A或者Protein G偶联的磁珠相比，Protein A/G磁珠可从更广泛的物种和同种型范围中捕获抗体或抗原，可应用于细胞裂解物、细胞分泌液上清以及其他的免疫抗原的分离纯化等。

【微珠属性】

适用范围  IP、Co-IP、ChIP、抗体纯化

磁珠浓度  10 mg/mL

磁珠直径  1 μm

IgG结合量  ＞80 μg兔IgG/mg磁珠

适用抗体种属  广谱抗体种属

耐受高温  不耐高温

配基  蛋白A/G

【试剂准备】

注意：使用前在Lysis buffer、IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer（圣尔#SB-IP011）中添加适量的蛋白酶抑制剂。

【使用说明】

使用方法以使用50 μL的磁珠进行免疫沉淀实验为例。可根据实际需要调整磁珠用量至25-50 μL，并参照此说明书体系调整对应试剂的用量；不建议使用超过50 μL，过量的磁珠将增加非特异性结合的可能性。

1. 抗原样品制备（样本类型包括血清、悬浮细胞、贴壁细胞、大肠杆菌）：

血清样本： 若目标蛋白丰度较高，建议用Lysis buffer稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10-100 µg/mL，置于冰上备用(或置于-20°C长期保存)。

悬浮细胞样本： 离心收集细胞(4°C，500×g，10 min)，弃上清后称重，按每毫克细胞50 μL的比例用1×PBS洗涤2次；按每毫克细胞5-10 μL的比例加入Lysis buffer，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10min；离心收集上清液(4°C, 1,4000×g, 10 min)，置于冰上备用(或置于-20°C长期保存)。

贴壁细胞样本 移去培养基，按每1.0×10⁵个细胞150 μL 的比例用1×PBS洗涤两次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5 mL EP管内，按每1×10⁵个细胞20-30 μL的比例加入Lysis buffer，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液(4°C，1,4000×g，10 min)， 置于冰上备用(或置于-80°C长期保存)。

大肠杆菌样本： 离心收集大肠杆菌(4°C，1,2000×g,2 min)，弃上清后称重，按每克（湿重）菌体10 mL的比例用1×PBS洗涤2次；按每克（湿重）菌体5-10 mL的比例加入Lysis buffer，同时加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM的PMSF），重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清(4°C，1,7000×g,10 min)。

2. 磁珠预平衡：

将磁珠充分混悬，取25-50 μL磁珠每反应，1 mL Lysis buffer洗涤3次，弃上清，每反应用100 μL Lysis buffer重悬磁珠。

3.抗体、抗原与磁珠结合

3.1 反应配置：

按照每反应1 mL细胞裂解液，25 μL磁珠（重悬于100 μL Lysis buffer），1-2 μg抗体，混合配置于1.5 mL EP管中。根据需要设置一组对照抗体反应管。

反应顺序三种建议：第一种抗体先与蛋白结合，再加入磁珠；第二种抗体先与磁珠孵育，最后加入蛋白；第三种同时加入。第一种与第二种相差不大，如果蛋白量过高（>1000 μg)建议使用第二种，否则蛋白容易吸附在磁珠上，降低得率。

3.2 抗体抗原结合：

置于翻转混合仪4°C翻转孵育过夜（8-24 h）

3.3 洗涤：

弃去上清，用1 mL Wash buffer翻转洗涤磁珠，每次5 min。

4 洗脱蛋白：根据后续检测方案选择不同的洗脱方法

4.1 变性洗脱法（此方法洗脱的样品适用于PAGE、WB检测）

彻底吸去剩余的上清液,加入30-50 μL的2×SDS-PAGE loading buffer重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍稍微量离心让样品沉淀。将样品加热95°C，10分钟。分离微珠，将上清液转移到新管。上清液为样品，用于后续SDS-PAGE、WB分析。

4.2 非变性洗脱法（此方法保持原有的生物活性，可用于功能分析、质谱分析，也适于抗体纯化）

分离微珠，弃上清，向磁珠中加入50 μL蛋白洗脱缓冲液（酸性），在室温或低温不停吹打或震荡30-60秒。室温洗脱比4°C效率更高，建议酸性洗脱缓冲液在室温下预温。分离微珠，收集上清至新管，并立即加入5 μL的中和缓冲液，使洗脱产物pH调节至中性，样品用于后续分析。

【注意事项】

1 严禁冻结。

2 密闭保存，避免干燥，保持微珠浸于储液。

3 本品为悬液，使用前需充分混匀，微珠彻底悬浮后吸取，使用过程中避免高速离心。

4 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，强烈建议在蛋白样品、Lysis buffer、Wash buffer中都添加适量的蛋白酶抑制剂。细胞裂解物可置于-80°C下长期保存。

5 裂解核蛋白，可在PIPA（强）裂解液中加入1mg/mL DNaseI、2.5 mM MgCl₂、蛋白酶抑制剂和1 mM PMSF。

6 在结合反应过程中，微珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象。

7 当目标蛋白分子量大小为50 kD或者25 kD时，建议更换轻链抗体/重链抗体，或使用纳米抗体磁珠，以尽量减少变性重链或轻链对SDS-PAGE和WB结果产生的干扰。

8 质控取样点1：样本充分裂解后，取数十微升样本，记作Input，即为反应前样本；质控取样点2：样本免疫沉淀孵育结束后，取上清样本10-50 μL，记作supernatant，即为上清样本。

9 缓冲液最大兼容性：1mM DTT（二硫苏糖醇）；3 M 脈盐•HCI；8 M 尿素；2 M NaCl；2% NP-40；1% SDS；1% Triton X-100

【常见问题】

问题1 目标条带较弱/没有

可能原因：样品降解，需添加蛋白酶抑制剂，所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融；抗体浓度太低，需增加抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度；抗体亲合力太低，选用适合于IP/co-IP的相应抗体。

问题2 背景太高

可能原因：在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前增加微珠预洗、免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂，如在第二次洗涤的步骤中增加NaCl浓度到500 mM）；改用高严谨度裂解液；使用洁净的仪器或液体；不要接触WB的膜转移面。

问题3 杂带较多

可能原因：磁珠的非特异性结合，或者样本上样量过高、或者抗体浓度过高。建议实验前对微珠增加漂洗，实验过程中增加洗涤次数，使用合适的样品和抗体浓度。

本产品仅供科研使用。