蛋白质免疫印迹法操作指南与产品推荐

蛋白提取

1.1 贴壁细胞蛋白提取步骤

• 准备裂解液：计算所需裂解液体积（通常每10⁶个细胞需要50-100μL裂解液），按比例加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（如果研究磷酸化蛋白），置于冰上
• 洗涤细胞：将培养皿/培养瓶从培养箱取出，吸弃培养基；用预冷的1×PBS洗涤细胞2-3次，每次加入足量PBS覆盖细胞膜表面，轻轻晃动后吸弃；最后一次洗涤后，尽量吸干残留的PBS
• 裂解细胞：向培养皿/培养瓶中加入计算好体积的预冷裂解液（确保能覆盖所有细胞）。将培养皿/瓶置于冰上孵育10-30分钟（具体时间根据细胞类型和裂解液强度调整），期间每隔几分钟，用移液器轻轻吹打细胞表面，或用细胞刮刀在冰上轻轻刮下细胞，帮助裂解。刮下的细胞裂解物转移至预冷的离心管中
• 超声处理（可选且推荐使用）：将离心管置于冰水浴中，使用超声波细胞破碎仪进行短暂超声。主要目的在于剪切DNA，降低粘稠度，提高裂解效率，使蛋白更易溶解。同时此步骤需要避免过度超声导致蛋白变性或产热
• 收集上清：将裂解液在4℃，12,000-16,000 g离心15-20分钟。将上清液转移至一个新的预冷的离心管中。注意避免吸入沉淀！

1.2 悬浮细胞蛋白提取步骤

• 准备裂解液：同贴壁细胞步骤
• 收集细胞：将细胞悬液转移至离心管中，4℃，300-500 g离心5-10分钟，沉淀细胞。小心吸弃上清（培养基）
• 洗涤细胞：用预冷的1x PBS重悬细胞沉淀，轻柔吹打混匀。4℃下，300-500 g离心5分钟，沉淀细胞。重复此洗涤步骤1-2次。最后一次离心后，小心吸弃上清，并用枪头吸干管壁残留的液体
• 裂解细胞：根据细胞沉淀量（估算细胞数或体积），加入适量预冷的裂解液（通常每10⁶细胞50-100 μL）。用移液器轻柔但彻底地吹打重悬细胞沉淀，确保无细胞团块。将悬液置于冰上孵育15-30分钟，期间每隔几分钟轻柔地涡旋震荡或吹打几次
• 后续步骤：同贴壁细胞步骤（超声处理、收集上清）

1.3 组织样本蛋白提取步骤

• 准备裂解液：同贴壁细胞步骤a。根据组织类型可能需要调整裂解液成分
• 取材及处理：
  • 新鲜组织：动物处死后迅速取材，用预冷的PBS或生理盐水冲洗干净血液和杂质，随后用滤纸吸干。立即置于液氮中速冻，然后转移至-80℃保存，或立即进行下一步匀浆
  • 冻存组织：从-80℃取出，保持冰冻状态进行后续处理
• 组织匀浆（此步骤在液氮或冰上进行）：
  • 液氮研磨法：将组织块（最好切成小块）放入预冷的研钵中，加入少量液氮，迅速用研杵将组织研磨成细粉（期间不断补充液氮，保持组织处于冰冻脆性状态），待液氮挥发殆尽但粉末仍保持低温时，将粉末迅速刮入装有预冷裂解液的离心管中
  • 电泳匀浆器/研磨珠法：将小块组织放入预冷的匀浆管或含有研磨珠的离心管中，加入适量预冷裂解液，在冰水浴中，使用电动匀浆器或研磨仪进行高速匀浆/研磨
• 裂解：将含有组织粉末/匀浆物的离心管置于冰上，持续震荡或间歇涡旋，孵育30分钟-2小时（根据组织类型调整，坚硬组织需更长时间）。期间可再次短暂匀浆或超声处理（冰浴中）以帮助充分裂解
• 收集上清：4℃下，12,000-16,000 g离心20-30分钟，吸取上清液，转移到新的预冷离心管中

蛋白定量

• 取适量上述步骤中未变性的总蛋白溶液，用BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度，测定方法如下：
• 按照试剂盒说明配制标准品及BCA工作液。以微孔板检测方法为例：
  • 各取10 μL标准品和待测样品加入到微孔板中（注：样品与工作液比例为1：20，检测范围为125-2000μg/mL。若样品浓度非常低，可使用25μL标准品和待测样品进行检测（即1：8），这时试剂盒的检测范围为20-2000μg/mL）
  • 每孔加入200 μL BCA工作液，枪头吹打充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30 min
  • 冷却到室温，在酶标仪上的562 nm波长范围处检测吸光度
  • 根据BSA标准品的吸光度(减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数)，绘制标准曲线。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度

蛋白变性

• 加入适量上样缓冲液，混匀
• 煮沸变性5-10分钟（95-100℃），短暂离心收集管壁液体
• 分装后于-80℃保存

凝胶配制

• 凝胶可参考文献资料进行配制，或者使用SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、PAGE凝胶快速制备试剂盒、预制胶等

上样与电泳

• 上样：胶凝固后取出梳子，将凝胶版装入电泳槽，内外槽加电泳缓冲液（需要没过凝胶上沿）；每孔上样20-50μg蛋白，预留一孔加预染蛋白Marker
• 电泳：恒压80V跑浓缩胶，进入分离胶后调至120V，直至溴酚蓝跑至胶底部（此处电压设置可根据实际情况调整，如文献或相关产品说明书）

• 转膜常用方法有湿式转印、半干式转印
• 湿式转印法：转印效率高且稳定，尤其适合大分子量蛋白（＞100 kDa）或厚凝胶，缓冲液容量大，产热相对分散。但是此法耗时长，消耗转印缓冲液较多
• 半干式转印法：快速，能够节省缓冲液。但是电流相对集中，易产热，可能影响转印效率
• 以下步骤以湿转PVDF膜为例：
  • 准备工作：配制足量预冷的转印缓冲液，PVDF膜用甲醇浸泡活化1-2分钟，将活化好的PVDF膜、滤纸、海绵垫完全浸没在预冷的转印缓冲液中平衡，同时将SDS-PAGE凝胶也浸入转印缓冲液中平衡几分钟
  • 组装"三明治"结构（在盛有转印缓冲液的浅盘中操作，保持湿润）：在转印夹黑色面（阴极，负极）上依次放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵，合上转印夹的另一半，确保各层对齐且无气泡、卡扣锁紧牢固，整个"三明治"结构紧密贴合
  • 放入转印槽：将组装好的装置放入转膜槽，确保夹子的黑色面（阴极）朝向转印槽的黑色电极（阴极），即凝胶侧接负极、膜侧接正极，加入预冷的转膜缓冲液，完全没过转印夹。放入冰盒或连接循环冷水浴（4°C）以维持低温，若使用圣尔的免冰浴免甲醇转膜液可不放冰盒或冰浴！
  • 设定运行条件：
    • 恒压：100V转膜60-90分钟（或根据蛋白分子量调整）
    • 恒流：100 kDa以下蛋白：200-250 mA；100 kDa以上蛋白：300-400 mA。时间：60-120分钟（根据蛋白大小、凝胶浓度调整，大分子量、高浓度胶需更长时间或更高电流）
  • 封闭：转膜结束后取出PVDF膜，放入孵育盒中，倒入足量的封闭液，室温下置于摇床缓慢振荡封闭1小时，或4℃过夜，以封闭膜上的非特异性结合位点

• 封闭后处理：封闭结束后用TBST洗膜3次，每次5-10min（去除未结合的封闭剂）
• 一抗孵育：加入稀释好的一抗（覆盖膜即可），4℃摇床孵育过夜（或室温2h）
• 一抗后洗涤：一抗孵育后，TBST洗膜3次，每次10min（去除未结合的一抗，减少背景）
• 二抗孵育：加稀释好的二抗，室温摇床孵育1-2h
• 二抗后洗涤：二抗孵育后，TBST洗膜3次（每次10min）

• 配制ECL化学发光液：1：1混合ECL A液和B液，现配现用
• 准备膜：将膜取出，用滤纸吸干表面液体，放在保鲜膜上
• ECL处理：均匀滴加ECL发光液，均匀覆盖膜表面，室温避光孵育1-2 min
• 显影：用滤纸吸去多余ECL液，将膜置于化学发光成像仪中曝光，调整曝光时间，捕获清晰条带图像

• 如果需要用不同一抗对同一张膜进行其他蛋白检测，推荐使用圣尔的抗体剥离液