从基础性质到应用场景的全面解析，助您精准选择核酸染料
核酸染料的性质与分类
核酸染料是分子生物学实验中用于可视化核酸（DNA/RNA）的关键试剂。一般是芳香环化合物，分子中含有苯环或吡啶环。这些环结构能够吸收紫外线或蓝光，并发出荧光。核酸染料通常带正电荷，而核酸（DNA和RNA）则带负电荷，这使得它们之间能够通过静电吸引相互结合。
根据化学结构、安全性和应用场景，主要可分为以下几类：
⚠️ 传统嵌入型染料
代表：溴化乙锭（EB）
通过嵌入核酸碱基对间发挥作用，但具有强致突变性。激发波长~302/366 nm，发射橙红色荧光（590 nm），灵敏度高（可检测10 ng DNA），价格低廉，但强致癌性需严格废物处理。早期琼脂糖凝胶电泳的主流染料，现逐渐被替代。
🟢 SYBR系列染料
代表：SYBR Green I, SYBR Gold，SYBR Safe
SYBR Green I结合双链DNA小沟区，激发/发射波长497/520 nm（绿光），灵敏度比EB高25-100倍；但稳定性差（pH敏感），且可进入活细胞，在紫外下仍具有诱变性。SYBR Gold灵敏度更高，适用于微量核酸检测。SYBR Safe安全性优化，降低细胞毒性。
🔴 Gel系列染料
代表：GelRed & GelGreen
大分子结构难以穿透细胞膜，安全性显著提升。GelRed激发/发射光谱与EB相似，可直接替代且无需更换成像系统；GelGreen可以兼容蓝光成像系统；两者灵敏度高于EB，稳定性好（可微波加热）。
🟡 经济型替代品
代表：GoldView
国内常用，但性能争议较大。宣称低毒，双链DNA呈绿色荧光，单链呈红色。但荧光易猝灭（5-10分钟），小片段（<500 bp）染色效果差，不适于胶回收，且具有细胞毒性和诱变性。
💧 新型安全染料
代表：EvaGreen，LC Green PLUS
EvaGreen是一种绿色荧光核酸染料，通过一种智能化的“按需释放”DNA结合技术，显示出比SYBR Green更低的PCR抑制性。LC Green PLUS是一种专门设计用于高分辨溶解曲线分析的饱和荧光染料，结合DNA双链，通过熔解曲线分析检测DNA双链中单碱基的变异。
⚙️ 特殊用途染料
代表：Hoechst/DAPI, 碘化丙啶（PI）
Hoechst/DAPI能特异性结合DNA小沟，可穿透活细胞膜，用于流式细胞术、荧光显微镜（细胞周期分析）；PI仅染死细胞核DNA，发射红光（615 nm），用于细胞凋亡检测。
核酸染料的应用场景
一、核酸电泳与凝胶成像
核酸电泳是基于带负电的DNA或RNA分子在电场作用下，通过凝胶介质（如琼脂糖或聚丙烯酰胺）的分子筛效应进行分离的技术。
1 实验步骤
- 凝胶制备：称取琼脂糖（如0.12g/15ml TAE缓冲液），微波加热溶解后冷却至50-60℃，加入荧光染料，倒入准备好的制胶板中。凝胶凝固后（约30-40 min），放入电泳槽并加入缓冲液至高出凝胶1 mm.
- 样品处理与加样：将DNA样品与上样缓冲液混合，用移液枪将样品加入凝胶孔中，避免气泡干扰。
- 电泳运行：设置电压，运行时间根据片段大小调整。观察溴酚蓝指示剂迁移位置，适时停止电泳。
- 成像分析：紫外激发下核酸染料发出荧光，通过凝胶成像系统拍摄，对比Marker判断片段大小和浓度。
2 核酸电泳核心应用场景
- DNA分析：PCR产物鉴定、克隆与载体构建、DNA指纹图谱
- RNA完整性检测：总RNA质控、Northern blot
- NGS样本质控：抽提核酸质控、文库质控
- 病原体分型与突变检测：脉冲场凝胶电泳、高分辨率熔解曲线
圣尔推荐产品：SB-gelred2001；SB-gelred2002；SB-gelgreen2003；SB-gelred2009；DYC-SUB2套装
二、PCR与实时定量分析
- 实时荧光定量PCR（qPCR）：SYBR Green I广泛用于qPCR，结合双链DNA后荧光增强实时监测扩增进程，通过Ct值定量。
- 熔解曲线分析：EvaGreen采用“按需释放”机制，抑制性更低，支持高染料浓度使用，提升溶解曲线。
- 数字PCR（dPCR）：EvaGreen因无染料迁移效应，支持多重扩增子同步检测，且在微滴数字PCR（ddPCR）中为唯一适用染料，可实现绝对定量。
圣尔推荐产品：SB-RT006；SB-Q204；SB-Q205
三、细胞生物学与显微成像
- 活细胞核酸标记：Hoechst 和 DAPI 可穿透活细胞膜，特异性结合 DNA 小沟（A-T 富集区），发射蓝光（~450 nm），用于流式细胞术的细胞周期分析及凋亡检测。
- 固定细胞染色：Helixyte iFluor 594适用于共聚焦显微镜
圣尔推荐产品：SB-H4047；SB-H4046；SB-P4034；SB-A4075；SB-D4076；SB-D4068；SB-D4054；SB-Y6002；SB-Y6026；SB-T6013
四、高通量筛选与诊断技术
- 病原体快速诊断：qPCR结合SYBR Green I用于病毒、细菌检测
- 遗传病筛查：通过熔解曲线分析检测单核苷酸多态性（SNP）或点突变，适用于肿瘤基因分型。
- 药物开发与毒性评估：评估化合物对细胞膜或DNA的损伤
核酸染料染色方法
胶染法（最常用）
- 步骤：制胶时直接加入染料（如每50 mL琼脂糖溶液加5 μL GelRed 10,000×储液），混匀后倒胶电泳。
- 优点：操作简便，染料用量少，片段分子量测定准确。
- 限制：不适用于聚丙烯酰胺凝胶；高温添加时需选耐热染料。
泡染法（兼容性高）
- 步骤：电泳后将凝胶浸入染色液，振荡30-60 min。
- 优点：适合所有凝胶类型，背景低，可重复使用染色液3次。
- 注意：聚丙烯酰胺凝胶需延长染色时间（随丙烯酰胺浓度增加）。
预染法/点染法（最节省染料）
- 步骤：样品与染料工作液混合，孵育10 min后上样。
- 优点：灵敏度最高，染料用量极少。
- 缺点：大片段DNA可能出现迁移滞后，影响分子量判断。
如何选择核酸染料
四步选择法
1. 评估风险：
优先选择：GelRed/GelGreen(穿透性低，Ames测试显示无诱变性)、EvaGreen（细胞膜穿透性弱）、SYBR Safe（蓝光激发，避免紫外损伤）
避免使用：EB（强致癌性）、GoldView(吖啶橙衍生物，毒性争议)
2. 明确灵敏度：
超高灵敏度：SYBR Gold（检测限达20 pg DNA）、LyGreen（HRM专用，灵敏度优于SYBR Green I）
常规检测：GelRed（与EB相当，小片段检测更优）、SYBR Green I（双链DNA灵敏度高）
3. 匹配实验方法：
常规电泳→ GelRed（安全替代EB）；qPCR → SYBR Green I；
高分辨率电泳 → 泡染法+SYBR Gold；细胞核标记→ DAPI/Hoechst；
微量DNA检测→ SYBR Gold；HRM分析→ LC Green PLUS（耐高温，适合高GC含量）；胶回收实验→ SYBR Safe/GelRed（低背景干扰）
4. 验证稳定性：
耐高温/酸碱：EvaGreen（95℃加热48小时无分解）、LC Green PLUS（高温熔解曲线分析稳定）
易降解：SYBR Gold（紫外照射易猝灭）、GoldView（胶回收不适用）
各类核酸染料综合比较
| 染料类型 | 作用机制 | 安全性 | 灵敏度 | 稳定性 | 适用场景 | 优点 | 关键缺陷 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| EB | 嵌入DNA双链碱基对间，紫外激发橘红色荧光 | ⚠️ 强致癌性 | 低（检测限≈10 ng） | 高（耐高温/光） | 传统电泳（逐步淘汰） | 经典、成本低 | 强诱变性，废弃物处理复杂 |
| SYBR Green I | 嵌入双链DNA小沟，结合后荧光增强100-300倍 | ⚠️ 中（增强紫外线诱变） | 极高（0.02 ng，EB的25-100倍） | 低（pH敏感，光稳定性差） | qPCR、高灵敏度电泳、RNA染色 | 高灵敏度、通用性强 | 抑制PCR，需严格优化浓度 |
| SYBR Gold | 结合单/双链DNA/RNA，荧光增强1000倍 | ✅ 高（Amesc测试通过） | 极高（20 pg DNA） | 中（避光保存） | 低丰度核酸检测、DGGE分析 | 灵敏度最高 | 光漂白严重 |
| GelRed/GelGreen | 二聚体嵌入DNA，油性结构减少迁移干扰 | ✅ 高（EPA认证） | 高（优于EB） | 高（耐微波加热，室温稳定） | 安全替代EB，兼容预制胶/泡染法 | 低毒、无需脱色 | 价格较高 |
| GoldView | 吖啶橙衍生物，结合双链DNA显绿色，单链显红色 | ⚠️ 中低（成分含吖啶橙） | 中（≈EB，>50 ng） | 低（紫外下5-10分钟淬灭） | 经济型常规检测 | 低成本、双链/单链区分 | 小片段染色差，荧光易猝灭，不适用胶回收 |
| EvaGreen | 饱和结合双链DNA，低PCR抑制性 | ✅ 高 | 高（0.1 ng DNA） | 极高（耐光/热） | qPCR、HRM分析 | 高稳定性、耐高温 | 价格较高 |
| LC Green PLUS | 饱和结合高GC含量DNA | ✅ 中高（低PCR抑制性） | 中高（HRM分辨率优） | 中（耐高温） | 熔解曲线分析（SNP分型） | 抗干扰性强 | 仅适用于特定片段成本较高 |
| PI（碘化丙啶） | 结合双链DNA磷酸骨架，无序列偏好性 | ⚠️ 强致癌性(生殖细胞诱变) | 中（10 ng DNA） | 低（游离PI在紫外光下易发生光解和荧光猝灭，需避光操作） | 流式细胞术、细胞周期分析 | 高特异性、成本低 | 无法区分单/双链DNA，需固定细胞 |
| Hoechst 33342 | 结合AT富集区DNA小沟，穿透活细胞膜 | ⚠️ 潜在致突变性（被列为疑似遗传毒性物质） | 高（1 ng DNA） | 低（需避光操作） | 活细胞核定位、细胞周期分析 | 低毒性、活细胞适用 | 光稳定性差 |
| DAPI | 结合双链DNA小沟，穿透活细胞膜 | ⚠️ 强致癌性 | 极高（1 pg DNA） | 高（耐紫外） | 荧光显微镜观察细胞核、凋亡检测 | 高分辨率、光稳定性强 | 高浓度有细胞毒性 |
部分测评结果展示
我们将圣尔的四款核酸染料和其它两家的产品进行了蓝光下显影和灵敏度测试，采用前染色方案。
具体步骤如下：
- 制胶：根据需要配制适当浓度的琼脂糖胶液，按照每100 mL胶液加入10 μL核酸染料。加热融化制胶，稍微冷却后，把核酸染料加入琼脂糖胶液，轻晃混合均匀后倒入制备凝胶的模具中，制小孔胶。
- 上样：梯度核酸样品展示染料灵敏度：DNA ladder体积依次为5 μL、2.5 μL、1.25 μL、0.625 μL、0.3125 μL
- 电泳：充分电泳，电压时间条件完全一致，记录电泳时间及电压
- 观察拍照：紫外灯/蓝光灯观察拍照
图1 蓝光灯下显色结果
圣尔SB-S2019 GelBlue安全染料可以兼容紫外发光和蓝光切胶仪。
图2 单个曝光的产品灵敏度对比
咱们的gelred2002灵敏度和性价比最高。
核酸染料常见问题解答
胶染法适合琼脂糖凝胶，操作简便（染料直接加入凝胶），但可能影响DNA迁移率；泡染法（电泳后染色）适合聚丙烯酰胺凝胶，减少干扰，适合精确分子量分析。分子量大的染料（如GelRed）推荐用泡染法。
可以，但不推荐。SYBR Green I在电泳中灵敏度极高（可检测0.02ng DNA），但pH敏感性强（需7.5-8.3），光稳定性差，且可能影响DNA迁移率。建议使用专门为电泳优化的染料如GelRed或SYBR Safe。
GoldView含有剧毒的吖啶橙成分，具有潜在致突变风险。此外，其荧光在紫外照射下5-10分钟就会淬灭，且对小片段DNA（<500bp）染色效果差，不适合需要高回收率的实验。
可能原因及解决办法：确保使用的染料终浓度为1×；DNA上样量过多（将DNA样品上样量减少至1/3或1/5）；凝胶浓度不合适（检测大片段DNA建议使用低浓度琼脂糖凝胶）；样品中Loading buffer过量（Loading buffer中的SDS可能会影响电泳效果，建议减少用量）；使用合适的电压；使用现配的电泳缓冲液。
1. EB等高危染料：需用活性炭吸附或专用降解剂处理，按有害化学废弃物处理
2. GelRed等安全染料：可用0.5%漂白剂处理30分钟后排放
3. 所有染料废弃物不应直接倒入下水道，需遵循实验室安全规程
可能原因包括：引物二聚体形成（优化退火温度或重新设计引物）；模板DNA降解（检测完整性）；染料浓度过高（按比例稀释）；扩增体系污染（加入dUTP/UNG防污染系统）。
建议：泡染后以1 mM MgSO₄冲洗凝胶；避免染料过量（SYBR Green I浓度过高易致DNA弯曲）；检查凝胶是否有杂质（如衣物荧光增白剂污染）；缩短曝光时间。
