酪酰胺信号放大技术（tyramide signal amplification, TSA）是一项在免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC），免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）和原位杂交（in situ hybridization, FISH）中都可以应用的染色手段。原理上来说，它依赖于抗体偶联的辣根过氧化物酶（HRP）在低浓度过氧化氢的作用下，与酪酰胺底物反应，形成的酶促产物大量沉积并结合在抗原-抗体周围的蛋白残基上，结合的荧光基团或化学发光基团能够以信号级联放大的形式被检测，提高了标记的敏感性。同时，对抗体的洗脱并不会去除原位的酪酰胺基团，使得用同一抗性的抗体做多通道标记成为可能，相当便捷。我自己在使用中，成功地检测到了在传统免疫荧光，免疫组织化学，甚至RNAscope都不能很好标记的低丰度靶标。下面是我的一些使用心得，仅供各位参考。
在我个人的使用中，我仅在传统免疫组化出现背景强，难以标记的情况下，才会考虑TSA染色。因为TSA染色的荧光孵育步骤其实抗体浓度稀释较宽（1：200-1：3000），有的时候过浓的抗体会带来过强的显色，严重影响统计和分析。另外，在考虑使用TSA染色的场景前，我需要确保一抗首先是好用的，可以先在高丰度的组织切片上确认这一点。最后，如果因为抗体抗性的原因，需要进行多通道共标的抗体种属有冲突，那首选TSA染色是应该的。（同种属的抗体可以用于TSA实验，详见下文往期介绍）
我仅仅检测过组织样本，所以固定细胞的染色在这里不能涵盖。经验上来说，和传统免疫染色一样，组织样本后固定的时间不宜过长，24小时至48小时即可。像我们实验室没有做石蜡切片的技术，我们都是将后固定组织交由公司切片。在这个过程中，如果在4%多聚甲醛或者福尔马林中后固定时间太久，有的抗原表位也许会受到影响，在之后的染色过程中即便不断调整抗原修复的策略，也始终得不到理想的结果。
3. 前处理
目前我选择应用TSA染色的标本，主要是小鼠组织的石蜡切片，和患者组织的石蜡切片。冰冻切片暂时不适用于这个步骤。
1） 首先为了确保脱腊和复水的有效，我会在烘箱中烤片一个小时，之后仅需要在二甲苯溶液中进行两次五分钟的脱腊就可以。实践上来说我认为脱腊和复水在有机溶剂中的时间不宜过长。
2）对抗原修复液的选择，我常用的是柠檬酸/柠檬酸钠溶液（ pH=6），这也是最广泛的。
3） 事实上，还有如Tris-EDTA溶液（pH=9）等可供选择。这也是一项可以摸索条件进行调整的地方。
4） 抗原修复的方式我选择的是微波处理，很重要的就是在微波加热的过程中要防止干片和暴沸。另外，由于我们实验室微波炉功率的欠缺，我们在一些很难标记的抗原进行修复的时候，会在微波加热后增加30至40分钟的沸水浴加热。
1） 这部分最重要的就是一抗，HRP二抗和荧光三抗（或者生物素三抗）的浓度和孵育时间。刚开始做的时候，我认为均选用理论最浓浓度，和较长孵育时间，比较合适。在判断信号有无和真实性之后，在进行抗体的稀释和时间的缩短，确保得到能统计定量的合适染色方案。
2） 阴参和阳参的设置是非常重要的。尤其是阴性参照。我们染过很多肠道组织的切片，以小肠组织为例，乳糜管中是非常容易出现非特异结合的，在实验组的片子中会显得非常亮。如果设置了同样非常亮的阴性参照（不孵育一抗），就会知道这样的信号是假的。
1） 和传统染色方法一样，也应该遵守“不好染”的抗体先染的规律。另外为了使荧光信号的数量级能够匹配，应该所有抗体均使用TSA染色，而不是仅有“不好染“的抗体用TSA进行信号放大。
2） 后续抗体的抗原修复也要严格按照前面的步骤进行，确保已经结合的HRP抗体能够洗脱剥离。
我在染色的时候也遇到过很多问题，一般来说，我解决问题的思路是，在确保阴参/阳参设置的前提下，先去判断信号的有无。如果仅仅是背景或者信号的深浅问题，那就去调整抗体稀释比例和孵育时间。如果确定没有阳性信号（抗体已使用高浓度稀释），那就不要浪费时间去调整抗体孵育的步骤了，检查下自己的抗原修复有没有问题（其他抗体同样的抗原修复染不染得出来），再往上检查样本处理有没有问题。再无法解决，那只能是一抗的选择了。一抗是怎么制备的，适用什么物种，结合蛋白什么区段，引用文献中究竟有没有拿来做染色的，都是要考虑的问题。
本文由圣尔生物TSA资深用户提供，在此深表感谢，因为文章还没有在线发表，所以可以分享的图片较少。
http://www.share-bio.com/product/990.html
也可详询我司销售，
销售微信