注意：对于其他细胞类型，如酵母、植物、昆虫、细菌，请使用等效的细胞溶解缓冲液

 

 

操作说明

 

1. 收集细胞：

 

对于一个免疫共沉淀反应，推荐使用 10⁶-10⁷ 个表达 GFP 融合蛋白的哺乳动物细胞。吸出培养液，加 1ml 预冷 1XPBS 于细胞中并刮下细胞，之后将细胞转入预冷的离心管中，4℃，800G 离心 3 分钟，弃上清液，用预冷 1XPBS 洗两次细胞沉淀物，轻轻重悬细胞。

 

2. 裂解细胞

 

1. 对于细胞质蛋白，用 200μL 预冷 Lysis buffer 重悬细胞

 

注：在 Lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂和 1mM PMSF  。

对于核蛋白可选做：加入 1mg/mL DNase、2.5mM MgCl₂、蛋白酶抑制剂 RIPA buffer 和 1mM PMSF

 

2. 将离心管放在冰上 30 分钟，每隔 10 分钟重悬细胞一次。

 

3. 4℃、16000g 离心 10 分钟，将上清液转移到一个新的预冷离心管中，加入 300μL

 

dilution buffer，丢掉沉淀。 如果需要，保存 50uL 裂解液进行进一步分析。

 

注：此步骤获得的细胞溶解物可置于-80℃下长期保存。

 

可选做：在稀释液中加入 1mM PMSF 和蛋白酶抑制剂。

 

3. 平衡磁珠：

 

1. 1. 1. 吸取 35uL 纯磁珠(70ul 混悬液）放在 1.5ml 离心管中

 

1. 1. 2. 加入 1ml 预冷 1xPBST,手拿上下晃动 60 秒，不要太剧烈

 

1. 1. 3. 放入磁力架静置分离磁珠 60 秒，直到上清液澄清，丢掉上清液，重复 3 次

 

4. 结合蛋白

 

1. 1. 在平衡好的磁珠中加入细胞裂解液 500ul

 

1. 2. 在 4℃用 翻转摇床旋转 1 小时

 

5. 洗涤

 

1. 1. 1. 用磁力架静置分离磁珠，直到上清液澄清，丢弃上清液。（如果需要，保存 50uL 上清液以供进一步分析）

 

1. 1. 2. 再加 1ml 预冷 1xPBST 悬浮磁珠

 

1. 1. 3. 磁力架静置分离磁珠，丢弃上清液，重复此步骤至少 4 次

 

6. 洗脱结合蛋白

 

1. 1. 除去剩余的上清液

 

1. 2. 用 40uL 1XSDS 样品缓冲液悬浮磁珠

 

1. 3. 将磁珠在 95°C 中加热 10 分钟，使免疫复合物与磁珠分离

 

6. 4. 用磁力架静置分离磁珠并在 SDS-PAGE 中分析上清液
7. 甘氨酸洗脱缓冲液洗脱（可替代步骤 6）
   1. 除去剩余的上清液

 

1. 2. 加入 70uL 甘氨酸洗脱缓冲液，并在 4°C 保存混匀 10 分钟

 

1. 3. 用磁力架静置分离磁珠，把上清部分转移到新的离心管里

 

立即用 35uL 中和缓冲液中和洗脱液部分