说明书下载链接：无内毒素质粒小提中量试剂盒
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货号： SB-213 |
50 次 |
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适用范围：适用于 5-15ml 中等规模质粒制备（mind preparations） |
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试剂盒组成 |
保存 |
50 次 |
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RNaseA |
4°c |
5mg |
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溶液 P1 |
室温 |
30ml |
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溶液 P2 |
室温 |
30ml |
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溶液 N3 |
室温 |
15 ml |
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溶液 N4 |
室温 |
70 ml |
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去蛋白液 PE |
室温 |
30ml |
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漂洗液 WB |
室温 |
20 ml |
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第一次使用前按说明加入80ml无水乙醇（即4倍体积） |
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洗脱缓冲液 EB |
室温 |
15ml |
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吸附柱 AC |
室温 |
50 个 |
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收集管（2ml） |
室温 |
50 个 |
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储存事项: |
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- 第一次使用时，将试剂盒所带的全部 RNase A 加入溶液 P1 后置于 2-8℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的质粒可能会有微量 RNA 残留，在溶液 P1 中补加 RNase A 即可。
- 环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
- 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：
本试剂盒采用改进 SDS-碱裂解法裂解细胞，通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。
产品特点：
独特工艺配方清除内毒素，内毒素含量极低（<0.1 EU/μg DNA），细胞转染效果极佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。
注意事项：
- 所有的离心步骤均在室温完成。
- 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，过夜培养14-16个小时，5-15ml培养物可提取出15-70µg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、N3的用量，其它步骤相同。
操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：第一次使用前请先在漂洗液 WB 瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
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- RNase A 全部加入溶液 P1 中，混匀，每次使用后置于 2-8℃保存。
- 取 5-15 ml 毫升过夜培养的菌液，10,000rpm 离心 1-2 分钟，尽可能的倒干上清，收集菌体。
- 用 500μl 溶液 P1 重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮，全部转入一个 2ml 离心管。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
- 加 500μl 的溶液 P2，温和地上下翻转 6 -8 次使菌体充分裂解，室温放置 4 分钟。温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组 DNA 剪切断裂！所用时间不应超过 5 分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的 5 分钟。
- 加 250μl 溶液 N3，立即温和地上下翻转 6 -8 次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。12,000rpm 离心 10 分钟，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮白色沉淀。
- 转移 0.95ml 上清液至 2.0ml 离心管，加入等体积 N4，颠倒旋转混匀，
- 将 5 步所得溶液分步加入吸附柱 AC 中（柱子最大体积 750ul），13000rmp 离心 30s
- 弃滤液，把柱子放入收集管，加入 500ul 漂洗液 PE .12000rmp 离心 30s
- 加入 600μl 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。再加入 600μl 漂洗液WB，重复漂洗一次。
- 将吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
- 取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 80-100μl 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃ 水浴中加热效果更好），室温放置 2 分钟，12,000rpm 离心 1 分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置 2 分钟，离心 1 分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于 50μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量
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